新型口蹄疫疫苗的研究进展：聚焦重组空衣壳

华派生物技术（集团）股份有限公司研发部 钟丽君编译

摘要：口蹄疫（FMD）是一种传染性极强的偶蹄动物疾病，给畜牧业带来巨大经济损失。虽然常用的灭活疫苗在防控口蹄疫方面效果显著，但仍存在诸多缺陷：生产设施需要高生物安全等级，且无法诱导免疫记忆。基于重组空衣壳技术开发的新一代口蹄疫疫苗展现出良好前景。其优势在于生产过程中无需使用病毒，并且保留了完整的构象表位特征。然而，要实现新型高效口蹄疫疫苗的量产，不仅需要具备免疫原性的抗原，还需配套工业级生产工艺。而现今重组空衣壳技术仍存在工艺流程复杂、难以规模化生产等问题。本文旨在系统梳理并比较目前已有的FMDV重组空衣壳生产工艺方案，重点探讨规模化生产的相关策略。

前言

口蹄疫（FMD）是一种高度传染的病毒性疾病，主要感染偶蹄动物，威胁着全球畜牧业的发展。许多国家仍通过常规疫苗接种计划来控制疫情。目前市场上大多使用的口蹄疫疫苗是通过悬浮培养的BHK-21细胞制备的灭活病毒制剂。然而，当前灭活疫苗生产存在一些缺陷，比如需要昂贵的生物安全设施，以及在灭活过程中存在病毒逃逸或失败的持续风险。这些生物安全问题促使不同国家禁止生产灭活疫苗。口蹄疫病毒完整表位库与空衣壳特有的颗粒结构及重复单元特性，能有效激发免疫保护应答，并且大量文献证实，这种特殊结构的抗原具有更优的免疫效果。因此，使用空衣壳作为类病毒颗粒（VLP）的疫苗和使用编码空衣壳形成基因的遗传物质作为遗传疫苗的疫苗（图1）更具发展潜力。因此，本综述分为两个部分：使用空衣壳的策略：VLPs；利用编码空衣壳的遗传物质的策略：DNA和病毒载体疫苗。

图1：口蹄疫灭活疫苗和新型类病毒颗粒及基因疫苗(DNA和病毒载体疫苗）：表达系统、抗原组成和免疫反应

生产重组FMDV空衣壳可以单独表达病毒结构蛋白VP0、VP3和VP1或表达P1-2A多聚蛋白（该多聚蛋白编码结构蛋白）和3C蛋白酶（负责将多聚蛋白切割为VP0、VP3和VP1)。表达后，一个拷贝的VP0、VP3和VP1会组装成原聚体，随后五个原聚体组合形成五聚体，最终十二个五聚体组装成口蹄疫病毒的空衣壳。

1. VLP

通过异源表达系统生产的重组口蹄疫病毒空衣壳（VLPs）疫苗是一种新型疫苗。这类病毒样颗粒由结构蛋白自发自组装形成，其结构与病毒相似但不含病毒基因组。VLP疫苗能激发强烈免疫反应的关键特性在于其颗粒形态和重复性蛋白基序结构。科研人员已探索多种异源表达系统，包括细菌、杆状病毒、哺乳动物细胞和植物，用于生产重组口蹄疫病毒VLPs。选择最合适的表达系统时，需综合评估重组VLPs的质量与产量，同时考量技术方案的成本效益、操作简便性以及工业化应用的可扩展性和通用性。

1.1 细菌

细菌是表达系统中最简单且最具经济性的选择，具有细胞生长速度快、培养条件要求低等优势。然而在口蹄疫病毒（FMDV）空衣壳生产领域，仅有少数研究者采用大肠杆菌作为宿主。通过该系统，结构蛋白可分别克隆至三个质粒中，串联整合于单一质粒中，或分置于两个质粒：一个同时编码VP0和VP3，另一个编码VP1。所有方案均通过共转化技术将大肠杆菌与单个、双或三个质粒共同表达这些结构蛋白。采用单质粒的优势在于仅需一种抗生素即可完成筛选和生产。蛋白质表达完成后，需要通过固定化金属亲和层析进行纯化，并使用SUMO蛋白酶对SUMO蛋白标签进行蛋白酶切，从而获得纯化的结构蛋白，随后组装成病毒样颗粒（VLPs）。

与所有原核表达系统类似，大肠杆菌在该体系中不会发生翻译后修饰。现有研究也均未提及VP0蛋白氨基末端缺乏肉豆蔻酰化修饰的现象，而这种修饰对口蹄疫病毒及其他小核糖核酸病毒的病毒颗粒组装和稳定至关重要。因此探究该系统表达的口蹄疫病毒结构蛋白能在不进行肉豆蔻酸修饰的情况下组装成病毒样颗粒（VLPs）的方法将具有重要科学价值。至于肉豆蔻酸缺失是否会影响这些空衣壳的稳定性，目前仍是一个悬而未决的问题。

1.2 杆状病毒

杆状病毒表达载体系统目前仍是生产重组口蹄疫病毒（FMDV）病毒样颗粒（VLP）最常用的平台。该系统的核心在于，先生产编码口蹄疫病毒基因的重组杆状病毒，随后用其感染昆虫或昆虫来源的细胞系，最终获得VLPs。该表达系统的显著优势在于完全不含可能危害哺乳动物的病毒和细菌毒素。

有两种策略对口蹄疫病毒多聚蛋白P1-2A和3C蛋白酶基因进行克隆：一种是通过双启动子系统（多角体蛋白启动子与p10启动子）实现型转录调控，另一种则是采用单启动子系统构建单一转录单元。相较于单独表达结构蛋白，采用多聚蛋白构建病毒样颗粒更具优势。未来的发展应评估通过二硫键形成的方式实现稳定化是否适用于所有血清型，同时应改进纯化工艺以获得工业可行的工艺。此外，从细胞质中提取VLP所需的细胞裂解步骤也是对大规模生产的挑战。

1.3 哺乳动物细胞

哺乳动物细胞的优势在于，能够生产出与原始蛋白高度相似的重组蛋白。不过，哺乳动物表达系统往往需要更复杂的生产工艺，特别是需要建立稳定细胞系。哺乳动物细胞的表达可以是瞬时表达或稳定表达。此外，表达过程可以通过质粒DNA或重组病毒进行调控。在哺乳动物细胞中生产重组蛋白的经典方法是采用稳定表达。尽管建立稳定细胞系需要耗费时间，但一旦成功建立，重组细胞系就能持续提供重组蛋白。然而当重组蛋白具有毒性时，瞬时表达往往更为合适。研究已证实与开发稳定克隆相比，瞬时表达更适合在贴壁培养的BHK-21细胞中表达P1-2A-3C蛋白，这一现象主要归因于3C蛋白酶的毒性作用。悬浮培养于无血清培养基中的293-6E细胞可实现高密度细胞培养，并便于规模化生产。该系统另一优势在于采用聚乙烯亚胺作为转染试剂，成本效益显著。

1.4 植物

已有研究报道了利用分子农业技术生产口蹄疫病毒重组空衣壳。通过转基因植物开发新型口蹄疫疫苗，可生产出成本效益高的抗原，这种抗原特别适合口服给药。有研究利用根癌农杆菌基因转移系统，成功培育出稳定转化的苜蓿和番茄植株，这些植株携带P1-2A-3C基因盒。实验数据显示，转基因苜蓿提取物能诱导小鼠产生抗口蹄疫病毒衣壳蛋白的免疫应答，而转基因番茄提取物则在豚鼠体内引发类似反应。但是他们的表达水平均偏低，且未能证实空衣壳结构蛋白的正确组装过程。

理论上，重组病毒样颗粒（VLPs）的抗原组成应不受表达系统影响。然而，由于实验中使用的口蹄疫病毒血清型不同，加之实验疫苗所用抗原剂量和纯度存在显著差异，无法对不同研究的VLP免疫原性进行比较。动物实验中既使用过纯化提取物也采用过粗提物。在已报道的纯化技术中，多数研究采用蔗糖梯度法进行VLP纯化，而仅使用SUMO标签的研究则采用Ni²⁺树脂。但由于SUMO标签的切割同样需要处理，纯化过程需经过两次色谱分离步骤。未来研究应改进适用于工业化生产的纯化技术，因为蔗糖梯度法与生产要求存在兼容性不足的问题。

2. DNA和病毒载体疫苗

在基因疫苗中，抗原性所需的基因序列被导入接种动物的细胞内，并通过宿主细胞机制进行表达。抗原完成内源性表达后，肽段会通过主要组织相容性复合体I类和II类途径呈现在细胞表面。因此，这类疫苗能同时引发体液免疫和细胞免疫反应。尽管已有充分证据表明，针对口蹄疫病毒（FMDV）的主要保护性免疫应答是中和抗体，但强烈的细胞免疫反应可能是实现长期免疫并避免持续感染的关键特征。正因如此，这类疫苗成为极具潜力的替代方案。

2.1 DNA疫苗

DNA疫苗的制备简便快捷，因为只需将目标基因克隆到表达质粒后，后续仅需在大肠杆菌培养中进行质粒生产及纯化。其核心在于实现无内毒素的质粒配方，为此通常采用阴离子交换树脂。疫苗的DNA成分确保了室温稳定性，这对于疫区国家的口蹄疫疫苗接种至关重要。然而，使用裸露DNA作为疫苗时存在转染效率低和DNA快速降解等主要缺陷，编码口蹄疫病毒空衣壳的DNA疫苗诱导保护性免疫应答的效果并不理想。为克服这些局限，研究人员提出了多种策略：包括采用不同质粒骨架、选用不同佐剂以及制定差异化免疫方案等。在DNA疫苗生产中，质粒通常含有一个选择标记基因，以便在大肠杆菌中进行生产。最常用的筛选标记基因是氨苄青霉素和卡那霉素抗性基因。然而，环境传播的风险和抗生素耐药病原体的出现应该鼓励研究人员寻找无抗生素的为应对未来法规要求，需要选择合适的质粒替代方案。

2.2 重组病毒载体

重组病毒载体可视为一种特殊的基因疫苗，其核心在于将目标抗原编码基因克隆到经过改造的病毒基因组中，并由真核启动子调控。当动物感染重组病毒时，这些基因会被精准导入宿主细胞。相较于DNA疫苗，病毒载体通常更具优势，因为病毒特有的受体能够精准引导外源基因整合到宿主细胞中。但是针对病毒载体本身的免疫反应可能会影响疫苗的整体效果。此外，病毒载体作为疫苗的大规模应用存在一个明显缺陷：需要耗费大量时间和人力来制备重组病毒的纯化制剂，而目前主流技术仍是氯化铯梯度离心法。

关于DNA疫苗与病毒载体疫苗的免疫原性的比较更为复杂。例如，DNA疫苗的成分以质粒μg为单位进行测量，而病毒载体疫苗则以重组病毒的感染单位作为衡量标准。通常情况下，病毒载体疫苗能取得更好的保护效果，而，DNA疫苗的优势在于其有极大的简便性。

展望

利用重组空衣壳生产新型口蹄疫病毒疫苗具有诸多优势，其中最重要的是不需要动用感染性病毒。从经济角度看，可省去复杂且昂贵的生物安全生产设施。从卫生角度看，使用空衣壳能完全杜绝因未完全灭活或病毒逃逸引发疫情的风险。因此，这种新型重组疫苗对目前禁止生产灭活口蹄疫疫苗的国家至关重要。

重组空衣壳可以通过表达编码VP0、VP3和VP1的多蛋白以及3C来产生。无论是通过蛋白酶还是单独表达VP0、VP1和VP3，两种策略的效果都存在差异。未来研发时，建议采用优化策略：仅在处理多聚蛋白所需水平表达3C蛋白酶，这样既能减少细胞内蛋白质的切割，又能避免其毒性作用。此外，A型血清株相较于O型血清株能获得更优效果。这种差异可能与空衣壳结构的稳定性问题有关。

基因疫苗与目前使用的灭活病毒疫苗存在本质区别。当动物体内完成基因内源性表达后，会自然产生空衣壳病毒颗粒。这种策略旨在构建免疫记忆，相比诱导细胞免疫反应而言更具优势。在基因疫苗领域，利用复制缺陷型人类腺病毒Ad-5表达口蹄疫病毒P1-2A-3C蛋白的重组策略，是当前最成熟的研发方案。该技术已在美国获得针对血清型A的紧急使用授权。与DNA疫苗相比，病毒载体疫苗的生产流程更为复杂且耗时较长，保质期也较短。此外，这些重组病毒疫苗可能引起的环境影响也备受重视。

图2 新型口蹄疫疫苗的优势比较

理想的口蹄疫病毒（FMDV）疫苗应当能引起持久的保护性免疫应答，同时还应该具有生产安全且工艺简便的优势。选择最佳新型疫苗时，不仅要评估其免疫原性，还需考量生产工艺的规模化可行性，从而确保其在工业生产中的应用价值。许多创新策略因流程复杂耗时，难以实现大规模生产而失败。鉴于重组空衣壳疫苗的免疫原性已获验证，开发口蹄疫新型疫苗时，应重点聚焦于重组空衣壳疫苗。