禽脑脊髓炎病毒在鸡胚适应过程中的进化

兽医科技

禽脑脊髓炎病毒在鸡胚适应过程中的进化

2026-08-31 12:56:53

华派生物俱乐部徐静编译

摘要野生型禽脑脊髓炎病毒（AEV）经口服或皮内感染可引起雏鸡出现神经症状，但对青年鸡无致病作用。然而，若该病毒通过在鸡胚中连续传代实现鸡胚适应，经皮内感染后可导致所有日龄鸡只发生禽脑脊髓炎（AE）。近期有报道称，数起蛋鸡青年鸡经皮内接种疫苗后不久发生禽脑脊髓炎的病例。本研究旨在确定是否因疫苗偶然适应鸡胚而导致这些疫情暴发。

研究从 2 种疫苗和 1 份田间样品中分离病毒。其中一种疫苗在疫情暴发前曾用于其中一个鸡群。初代传代后，无论接种何种接种物，均未出现鸡胚瘫痪现象，表明疫苗和田间分离株均未发生鸡胚适应。传至第 7 代后，3 个毒株均完全实现鸡胚适应，可引起鸡胚出现典型病变。通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）测定的病毒载量在传代过程中保持稳定。

疫苗、田间样品及另外 4 株田间分离株的 VP2 基因部分序列几乎完全一致，且与全球已发表的序列高度相似；仅来自未免疫鸡只的序列存在明显差异。全基因组分析鉴定出 2 个单核苷酸多态性（SNP），可区分野生型毒株和鸡胚适应毒株。对 5 株田间分离株以及分离株第 1、3、5 代传代物的脑组织和神经组织进行桑格测序，结果显示，指示鸡胚适应的突变首次在第 5 代出现。

关键词：小 RNA 病毒、震颤病毒、毒力、系统发育、嗜性

引言

禽脑脊髓炎（AE）由同名病毒（AEV）引起，该病毒是小 RNA 病毒科震颤病毒属的唯一成员。易感雏鸡经垂直或水平途径（口服或皮内）感染后，会出现以震颤、共济失调以及因腿部进行性无力或麻痹导致行走困难为特征的神经症状。若病鸡无法获取饲料和饮水，则可能死亡。产蛋鸡经口服或皮内途径感染后，会出现短暂的产蛋量下降。因此，蛋鸡广泛接种疫苗。种鸡也必须接种疫苗，以传递母源抗体，保护雏鸡在易感期免受感染。

疫苗毒株与田间毒株相同，在蛋鸡和种鸡 10 至 16 周龄时，通过口服或翅膀皮内接种。该日龄的鸡只感染后不会出现临床疾病，但会诱导产生持久免疫力。这种免疫力不仅能保护产蛋期母鸡，还能通过母源抗体保护后代。若病毒在鸡胚中传代次数过多（例如疫苗生产过程中），则可能发生鸡胚适应。鸡胚适应的禽脑脊髓炎病毒毒株会变为嗜神经性，丧失经口感染鸡只的能力，但经皮内接种后，可导致所有日龄鸡只出现临床疾病。田间毒株不会引起鸡胚病变，而鸡胚适应毒株会导致鸡胚瘫痪和发育迟缓。

近期有报道称，数起 11 至 14 周龄的蛋鸡青年鸡经翅膜刺种疫苗后发生禽脑脊髓炎。这些非典型感染的可能原因包括：所用疫苗传代次数过高从而发生鸡胚适应、鸡只免疫抑制，也有可能是疫苗误进行肌肉注射，导致所有日龄鸡只出现神经症状。

本研究旨在探究第一种可能性，即所用疫苗发生鸡胚适应。此外，本研究对野生型和鸡胚适应型禽脑脊髓炎病毒毒株进行测序，以鉴定与鸡胚适应相关的突变。

材料与方法

2.1 疫苗与样品

本研究检测了 2 种活疫苗：疫苗 A（英特威公司），该疫苗在疫情暴发前曾用于其中一个鸡群；疫苗 B（梅里亚公司），用于未发生禽脑脊髓炎的青年鸡群。两种疫苗均为禽脑脊髓炎和禽痘二联疫苗，通过翅膜接种。加利福尼亚州的 5 例禽脑脊髓炎病例中采集 6 份脑组织或神经组织样品，标记为田间 A 至田间 E。这些病例包括森蒂埃斯 - 奎等详细报道的 3 起疫情。

2.2 禽脑脊髓炎病毒分离株的分离与传代

分离疫苗 A 和 B 毒株时，取 50 微升疫苗用 5 毫升含抗生素 / 抗真菌溶液的胰蛋白胨磷酸盐肉汤（TPB）稀释（青霉素 10000 单位 / 毫升、链霉素 10 毫克 / 毫升、两性霉素 B25 微克 / 毫升，100 倍浓缩液）。加入 250 微升氯仿后，混合物在室温下孵育 10 分钟，期间反复混匀，以灭活两种疫苗中含有的禽痘病毒。随后，样品以 100×g 离心 5 分钟，取上层水相用于鸡胚接种。

从脑组织样品（田间 A）中分离病毒时，将组织反复冻融 3 次，在塑料袋中机械研磨。取约 1 毫升研磨物用 4 毫升含抗生素 / 抗真菌溶液的胰蛋白胨磷酸盐肉汤稀释，超声处理后，用 45 微米注射器滤器无菌过滤。

取 0.1 毫升病毒悬液或胰蛋白胨磷酸盐肉汤，接种于 6 至 7 日龄的无特定病原体鸡胚卵黄囊内。每个组别（疫苗 A、疫苗 B 和田间 A）各接种 25 至 30 枚鸡胚。接种后 24 小时内死亡的鸡胚归为非特异性死亡。24 小时后每日照蛋，检测特异性鸡胚死亡。鸡胚发育至 19 日龄时，打开鸡胚进行检查。观察每枚鸡胚的活动或瘫痪情况，去除附着的卵膜和卵黄囊残留物后单独称重。

每个分离株组取 5 至 6 个完整鸡胚头部合并，加入约等量含抗生素 / 抗真菌溶液的胰蛋白胨磷酸盐肉汤，匀浆后超声处理。混合物以 20000×g、4℃离心 10 分钟，去除残渣。上清液经无菌过滤后用于下一代传代，每组共传代 7 次。实验全程设置模拟接种对照组。

2.3 组织病理学

所有组别第 7 代的完整鸡胚用 10% 中性福尔马林固定，组织修整后按常规方法处理并包埋于石蜡块中。切片厚度为 5 微米，置于载玻片上，采用标准方法进行苏木精 - 伊红染色，通过光学显微镜观察。

2.4 用于病毒载量监测和 VP2 基因部分序列测定的 RNA 制备

按照试剂盒说明书，使用 RNEasy 小提试剂盒从组织匀浆和疫苗中提取 RNA。对于感染鸡胚，使用超声处理后的头部匀浆；对于田间样品，使用未用胰蛋白胨磷酸盐肉汤稀释的脑组织或神经组织匀浆。按照试剂盒说明书，使用 Turbo DNA-free 试剂盒对用于病毒载量测定的 RNA 进行脱氧核糖核酸酶处理。

2.5 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测病毒载量

使用 QuantiNova 探针法逆转录聚合酶链反应试剂盒（凯杰公司）进行禽脑脊髓炎病毒和 β- 肌动蛋白 RNA 的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测。在 10 微升主反应液中，加入 10 皮摩尔的各引物和探针（表 1）、2 微升模板 RNA、0.2 微升酶混合液，再用无核酸酶水补足至总体积 10 微升。扩增程序为：45℃逆转录 10 分钟，95℃预变性 5 分钟，随后 45 个循环（95℃变性 5 秒，60℃退火延伸 1 分钟）。在退火延伸步骤后收集荧光信号。所有样品均进行 3 次重复检测。为测定扩增效率，将样品用无核酸酶水进行 10 倍梯度稀释。对原样品及稀释至 10-4 的样品各进行 3 次重复检测。使用伯乐 CFX 管理器 3.1 软件，采用回归法计算定量循环数（Cq）和扩增效率。根据平均定量循环数及测定的 β- 肌动蛋白扩增效率（E_beta-act）和禽脑脊髓炎病毒扩增效率（E_AEV），按照公式计算禽脑脊髓炎病毒相对 β- 肌动蛋白 RNA 的病毒载量。

表1 病毒载量RT-qPCR和测序用靶序列、目标区和引物扩增片段大小及探针

2.6 VP2 和 VP3 基因部分序列测定及与已发表序列的比对

使用引物 MK AE1 和 MK AE2（通过逆转录聚合酶链反应扩增多聚蛋白基因 VP2 区 619 碱基对片段。使用引物 AEseq_For_3 和 AEseq_Rev_3 扩增多聚蛋白基因 VP3 区 788 碱基对片段。聚合酶链反应产物使用 QIAquick 聚合酶链反应纯化试剂盒纯化，进行正反向测序。

选取 VP2 基因 539 碱基对序列，使用 Phylogeny.fr 软件进行系统发育分析，采用默认设置，使用 MUSCLE 软件进行序列比对，PhyML 软件构建系统发育树并计算近似似然分支支持度。所有序列信息见表 2。

2.7 全基因组测序

尝试对 2 种疫苗、田间分离株 A 的脑组织匀浆及 3 个毒株的第 7 代传代物进行全基因组测序。取 100 微升疫苗或脑组织匀浆，使用 Trizol 试剂提取 RNA，异丙醇沉淀后重悬于 30 微升无核酸酶水中。使用 Turbo DNA-free 试剂盒去除 DNA，随后使用 Terminator 5'- 磷酸依赖性核酸外切酶按照说明书去除核糖体 RNA。加入乙二胺四乙酸至终浓度 5 毫摩尔 / 升终止反应，使用 QIA 病毒 RNA 试剂盒（纯化，不添加载体 RNA，洗脱体积为 30 微升。

使用 2100 生物分析仪通过 RNA 微芯片评估核糖体 RNA 污染情况。使用 NEBNext 超高效定向 RNA 文库制备试剂盒制备 6 个互补 DNA 文库，使用 Illumina HiSeq 3000 平台进行 100 碱基对双末端测序。

将测序文库与鸡基因组（Galgal-5.0）比对，使用 Tophat 2 软件去除宿主来源的读段。使用 A5 组装流程（科伊尔等，2015）将未比对的读段组装成重叠群，通过 NCBI-BLAST + 软件鉴定与已知病毒基因最相似的病毒重叠群。

田间样品仅获得 3 个重叠群，总长度 1272 碱基对。为获取田间分离株 A 的基因组，额外设计 8 对引物，共覆盖 6042 碱基对。结合这些引物及 MK AE1/MK AE2、AEseq_For_3/AEseq_Rev_3 引物对，通过逆转录聚合酶链反应扩增 10 个片段并测序。使用 MacVector 软件将序列与美国毒株序列比对组装。

2.8 全基因组分析

使用 Clustal omega 软件将所得序列与美国毒株、范・罗克尔毒株及匈牙利、香港分离株序列进行比对。选取 VP2 基因 222 个氨基酸、完整 VP3 基因（245 个氨基酸）、聚合酶基因（486 个氨基酸）和 ATP 酶基因（326 个氨基酸）的氨基酸序列，使用上述 Phylogeny.fr 软件进行系统发育分析。

2.9 统计分析

采用单因素方差分析和邓尼特多重比较检验，比较鸡胚平均体重与对照组鸡胚体重差异。使用 Prism 软件（格拉夫帕德软件公司，美国加利福尼亚州拉霍亚市）进行统计分析。

结果

3.1 禽脑脊髓炎病毒毒株的分离与传代

从 2 种疫苗（A 和 B）和 1 份田间样品（田间 A）中分离病毒。疫苗 A 在疫情暴发前曾用于其中一个鸡群，疫苗 B（不同厂家生产）用于未发生禽脑脊髓炎的青年鸡群。初代传代后，无鸡胚出现瘫痪。第 2 代传代后，疫苗接种组出现瘫痪鸡胚；田间分离株 A 首次引起鸡胚瘫痪出现在第 3 代。传至第 7 代后，所有接种任一毒株的鸡胚均出现瘫痪。同时，鸡胚发育至 19 日龄时的平均体重从 22.5-24.2 克降至 15.4-16.7 克。禽脑脊髓炎病毒特异性鸡胚死亡率波动较大，但随传代次数增加逐步升高，从初代的 3.6%-11.1% 升至第 7 代的 17.2%-35.7%（表 3）。模拟接种对照组未出现瘫痪鸡胚，鸡胚平均体重在 20.4 克至 24.5 克之间，可疑死亡率为 3.6%-14.3%。除疫苗第 4 代和田间 A 第 5 代外，其余各代接种鸡胚平均体重均显著低于相应对照组（P<0.05）（表 3）。

表3 7代每代在胚19日龄时的瘫痪率、死亡率及均重，每种病毒接种25-30枚胚

任一病毒分离株第 7 代鸡胚的组织病理学病变在脑部最为严重，表现为局灶性出血、软化、水肿、胶质细胞增生、新生血管形成和矿化。病变还包括骨骼肌纤维严重变性坏死、骨骼肌纤维严重萎缩、心肌炎和腺胃炎（图 1）。模拟接种对照组鸡胚未观察到病变。

图 1 接种禽脑脊髓炎病毒（AEV）田间分离株或疫苗株的鸡胚适应第 7 代毒株后，鸡胚出现的组织病理学病变。苏木精 - 伊红（HE）染色。

A1：脑部局灶性出血、软化与胶质细胞增生 A2：脑部局灶性水肿、胶质细胞增生与新生血管形成 B：骨骼肌纤维严重萎缩 C：骨骼肌肌纤维严重变性、坏死 D：心肌炎 E：腺胃炎

对田间分离株 A、疫苗 A 和疫苗 B 第 1、3、5、7 代鸡胚头部进行病毒载量检测。以鸡 β- 肌动蛋白 RNA 为内参，通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应测定病毒载量。鸡胚于 6 至 7 日龄接种，19 日龄检测。

禽脑脊髓炎病毒实时荧光定量逆转录聚合酶链反应扩增效率（E_AEV）为 1.934，β- 肌动蛋白扩增效率（E_beta-act）为 1.967。测定第 1、3、5、7 代病毒相对 β- 肌动蛋白信使 RNA 的载量。3 种病毒之间及传代过程中病毒载量相近，仅田间样品原始样品病毒载量低于其他样品 1%（图 2）。

图 2 分别接种田间分离株 A、疫苗 A 和疫苗 B 的第 1、3、5、7 代病毒后，鸡胚头部的病毒载量。病毒载量采用 RT-qPCR 法，以鸡 β- 肌动蛋白 RNA 为内参进行相对定量。鸡胚于 6～7 日龄接种，19 日龄取样检测。

3.2 VP2 基因部分序列测定及与已发表序列的比对

基于核糖核酸序列构建的系统发育树显示，加利福尼亚州所有田间样品、美国毒株、韩国疫情分离株、沙特阿拉伯未知背景分离株，以及 2 种疫苗和田间样品第 7 代传代物序列同源性均超过 99.6%，聚为一簇。2 种疫苗毒株第 7 代传代物与上述序列同源性为 99.4%-99.6%，但与鸡胚适应范・罗克尔毒株及 2 株中国未知背景分离株聚为一簇，这 3 个序列与主簇同源性约为 95%。香港健康鸡、匈牙利腹泻鸡和英国患病雉鸡的分离株序列明显分化，与主簇同源性低至 80%（图 3）。

图3 基于VP2 基因539 个碱基序列构建的系统发育树。比例尺代表每个位点的核苷酸替换数；分支支持度大于 0.5 的近似似然值已在图中标注。序列信息及对应的基因登录号详见表 2。

3.3 全基因组分析及鸡胚适应后的标记

将所得序列（2 种疫苗、田间病毒及其第 7 代传代物）与美国毒株、范・罗克尔毒株及匈牙利、香港分离株序列进行比对。仅发现 2 个单核苷酸多态性（SNP）与鸡胚适应相关。一个位于 VP2 区 1120 位核苷酸，野生型毒株编码谷氨酰胺，鸡胚适应毒株编码精氨酸；另一个位于 VP3 区 1408 位核苷酸，野生型毒株编码苏氨酸，鸡胚适应毒株编码异亮氨酸（图 4）。原始疫苗中，指示鸡胚适应的读段占比低于 1%（疫苗 B 1120 位无相关读段）；相比之下，第 7 代传代物中相关读段占比为 18.1%-99.2%（表 4）。对田间病例及田间分离株 A、疫苗 A 和 B 第 1、3、5 代传代物的脑组织或神经组织进行桑格测序，结果显示，该方法首次在第 5 代检测到指示鸡胚适应的突变（图 4）。

图 4 与鸡胚适应相关的单核苷酸多态性位点。图中高亮标出两个关键位点：左侧为 VP2 基因区第 1120 位，右侧为 VP3 基因区第 1480 位（位点编号参照美国毒株基因组）。氨基酸序列以美国毒株为标准序列，* 代表保守位点。含第二个单核苷酸多态性位点的野外毒株 B 扩增产物信号较弱，测序质量不达标。

表 4 本研究中测定的基因组内与鸡胚适应相关单核苷酸多态性（SNP）的碱基读取数

基于 VP2 部分氨基酸序列及完整 VP3、聚合酶和 ATP 酶基因氨基酸序列构建的系统发育树结果不一致，整体上香港和匈牙利分离株与其他序列存在明显差异（图 5）。

图 5 基于 VP2 基因 222 个氨基酸、完整 VP3 基因（245 个氨基酸）、聚合酶基因（486 个氨基酸）及 ATP 酶基因（326 个氨基酸）构建的系统发育树。标尺代表每个位点的核苷酸替换数；图中显示大于 0.5 的近似似然分支支持度值。A：VP2；B：VP3；C：聚合酶；D：ATP 酶。

讨论

本研究旨在确定近期青年鸡禽脑脊髓炎疫情暴发是否因疫苗意外发生鸡胚适应所致。该报道并非首例描述蛋鸡经口服或翅膜接种疫苗后暴发禽脑脊髓炎的文献，所有这些研究均难以确定根本原因。在疫苗鸡胚适应、青年鸡免疫抑制、接种方式错误三种可能原因中，只有鸡胚适应可事后验证。田间病例未发现免疫抑制迹象。

田间分离株及用于问题鸡群的疫苗 A 均未引起鸡胚病变，表明致病分离株和疫苗均未发生鸡胚适应。然而，田间分离株与疫苗的基因组几乎完全一致，这可能提示疫苗引发了临床症状。

另一方面，田间分离株与疫苗的高度相似性不能作为确凿证据，因为全球禽脑脊髓炎病毒序列高度保守。尽管已知禽脑脊髓炎病毒无不同血清型，一大群分离株的 VP2 基因片段同源性极高，这一点非常明显。这些序列包括卡尔内克博士提供给马维尔等（1999）的毒株基因组。鉴于卡尔内克博士在研发禽脑脊髓炎疫苗中的作用，目前使用的许多疫苗很可能源自该毒株，这也解释了其与本研究检测的 2 种疫苗高度同源的原因。其他国家疫情相关序列的病例信息尚未发表。然而，考虑到疫苗的广泛使用及疫苗株具有完全毒力的特点，这些病例很可能由疫苗株引起。事实上，仅香港、匈牙利未免疫散养鸡及英国未免疫雉鸡的序列存在差异。

将田间分离株及 2 种疫苗病毒在鸡胚中连续传代，仅需 7 代即可完全实现鸡胚适应，远低于巴特菲尔德等报道的 8 至 20 代。这可能与疫苗生产过程中已进行传代有关。第 2 代即出现鸡胚适应的初步迹象，表明疫苗生产商在毒株传代时保留了较小的安全余量。

鸡胚脑部和骨骼肌的病变与文献报道一致。据我们所知，此前尚未有关于鸡胚心脏和腺胃病变的报道。田间暴发禽脑脊髓炎的雏鸡也观察到类似病变。鸡胚死亡率略有升高，这并非鸡胚适应禽脑脊髓炎病毒分离株的典型特征。

除田间分离株初代传代外，病毒载量在传代过程中几乎保持恒定，这可能是因为田间样品病毒载量同样较低。由于该材料用于接种下一代鸡胚，这也解释了为何田间分离株出现鸡胚适应迹象晚于疫苗毒株。另一方面，病毒载量基本恒定也表明禽脑脊髓炎病毒的鸡胚适应与病毒复制效率无关。已有研究证实，鸡胚适应的禽脑脊髓炎病毒在鸡胚、1 日龄雏鸡和产蛋鸡中发生器官嗜性改变，这似乎是鸡胚适应的唯一机制。

结果表明，这种器官嗜性的改变由 VP2 和 VP3 的 2 个点突变引起，这与柯萨奇病毒类似，柯萨奇病毒 VP2 和 VP3 的 2 个点突变会改变病毒的结合特性。要明确证实这 2 个点突变是鸡胚适应的原因，需要在非鸡胚适应分离株中引入该突变，再感染鸡只复制疾病。此外，尚需确定这 2 个突变是否均为器官嗜性改变所必需，还是任一突变即可。

全基因组测序显示，疫苗 A 中存在 2 种突变，疫苗 B 中仅检测到第 2 种突变。该突变可能确实不存在，在后续传代中出现是自发突变的结果。然而，更有可能的是该突变含量极低，未被检测到。已有研究表明，并非所有禽脑脊髓炎病毒分离株都能适应鸡胚。显而易见的解释是，这些分离株中不存在相关突变。从应用角度来看，筛选到此类分离株或通过噬斑纯化、反向遗传学获得该分离株，可制备出安全性更高的疫苗。

总之，本研究表明，致病禽脑脊髓炎病毒分离株及所用疫苗均未发生鸡胚适应。然而，测序结果提示，疫苗可能因误肌肉注射或青年鸡免疫抑制，导致加利福尼亚州近期疫情暴发。此外，本研究鉴定出指示鸡胚适应的基因标记（VP2 和 VP3 突变）及其发生风险。

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