《畜牧兽医学报》2025年第56卷第11期刊登了中国农业科学院兰州兽医研究所 动物疫病防控全国重点实验室张亚岭, 景伟, 赵妍, 何小兵, 房永祥, 苏洋, 李小明, 张慧, 景志忠, 陈国华的文章——“牛结节性皮肤病病毒ORF002蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立”，该文由“十四五”国家重点研发计划(2023YFD1802501)；兰州市科技计划项目(2023-1-38)；国家自然科学基金面上项目(32473069)；甘肃省科技重大专项(23ZDNA007)；国家动物疫情监测与防治专项(125161031)资助。该研究的创新点:首次利用牛结节性皮肤病病毒(LSDV)特异性ORF002膜蛋白建立无活病毒，高通量间接ELISA，实现安全、价廉、基层适用的抗体检测。

 研究背景与目的

2019 年， LSDV 入侵中国后快速扩散，临床急需安全、高通量、适合基层的血清学诊断工具；ORF002 为 LSDV 特异性基因，可区分山羊痘/绵羊痘，但尚无基于该蛋白的 ELISA 报道。本研究旨在构建 ORF002 原核表达系统，建立并优化配套间接 ELISA，用于临床抗体检测与疫苗效果评价。

1 材料与方法
1.1 菌株、质粒及血清样品

载体：pET-30a(+)；宿主：E. coli DH5α/BL21(DE3)。毒种：LSDV/Xinjiang/China/2019（ABSL-3 保存）。血清：阴性牛血清、人工感染阳性血清。

1.2 主要试剂

分子克隆，His-标签鉴定，BCA 定量，HRP-兔抗牛 IgG，封闭/稳定/稀释液等。

1.3 LSDV ORF002 蛋白的生物信息学分析

工具：ProtParam、SOPMA、SWISS-MODEL、TMHMM、SVMTriP。结果：131 aa，13 ku，1 个跨膜区，胞外区 104 aa，亲水性高，抗原表位丰富。

1.4 引物的设计与合成

参考株 NI-2490，SnapGene 设计，引入 NdeⅠ/XhoⅠ位点，扩增 337 bp。

1.5 LSDV ORF002 基因的扩增及重组表达载体构建

高保真 PCR → 双酶切 → T4 连接 → DH5α 转化 → 测序验证，获得 pET-30a(+)-ORF002。

1.6 LSDV ORF002 蛋白诱导表达及鉴定

0.5 mmol·L⁻¹ IPTG、37 ℃ 4 h；SDS-PAGE 显示 13 ku 特异条带，包涵体为主；Western blot 可识别 LSDV 阳性血清。

1.7 LSDV ORF002 蛋白的纯化及鉴定

8 mol·L⁻¹ 尿素溶解包涵体 → Ni-NTA 亲和层析 → 梯度透析复性 → BCA 定量 → -80 ℃ 保存，纯度 >90 %。

1.8 间接 ELISA 方法的建立
1.8.1 最佳抗原包被浓度及血清稀释度确定    棋盘滴定：2.5 μg·mL⁻¹ ORF002 + 1:100 血清，P/N 最大。

1.8.2 最佳封闭液确定     Casein blocking buffer P/N 最高，选为封闭剂。

1.8.3 最佳酶标抗体稀释比例确定    HRP-兔抗牛 IgG 1:120 000 时 P/N 峰值。

1.8.4 临界值确定    ROC 分析 124 份背景明确血清，AUC=0.971；判定：样本 OD_{450 nm} ≥ 阳性标准 OD_{450 nm} ×20.34 % 为阳性。

1.8.5 特异性试验    与 FMDV-A、FMDV-O、布鲁氏菌、BVDV 阳性血清无交叉，特异性 100 %。

1.8.6 重复性试验    6 份阴阳性血清，批内/批间 CV<7.4 %，稳定性良好。

1.8.7 符合性试验    54 份血清 vs 商品竞争 ELISA，总符合率 92.59 %。

2 结果

2.1 LSDV ORF002蛋白的生物信息学分析 

全长131 aa，分子量≈13 ku；含1个跨膜区，胞外区104 aa；亲水性高、不稳定指数<30，预测有多个线性B细胞表位，适合原核表达及血清学诊断抗原（图1）。

2.2 LSDV ORF002重组质粒构建及鉴定 

PCR扩增得到337 bp目的条带；双酶切（NdeⅠ/XhoⅠ）后成功插入pET-30a(+)，测序无突变，读码框正确，质粒命名为pET-30a(+)-ORF002（图2）。

2.3 LSDV ORF002蛋白的表达纯化及鉴定 

0.5 mmol·L⁻¹ IPTG，37 ℃诱导4 h，13 ku重组蛋白主要存在于包涵体；经8 mol·L⁻¹尿素溶解、Ni柱亲和层析及梯度透析复性，SDS-PAGE显示单一条带，Western blot可被LSDV阳性血清识别，反应原性良好（图3）。

2.4 间接ELISA方法的初步建立

2.4.1 最佳抗原包被浓度及血清稀释度确定    棋盘滴定：抗原2.5 μg·mL⁻¹ + 血清1:100时P/N最大（5.09），确定为最适工作浓度（表 2）。

2.4.2 最佳封闭液确定    比较4种封闭剂，Casein blocking buffer P/N最高，选为封闭液。

2.4.3 最佳酶标二抗稀释比例确定   HRP-兔抗牛IgG 1:120 000时P/N峰值，确定为最佳稀释度。

2.4.4 临界值确定   ROC分析124份背景明确血清，AUC=0.971；样本OD_{450 nm}≥阳性标准OD_{450 nm}×20.34%判为阳性，灵敏度93.2%，特异性97.5%（图4）。

2.4.5 特异性试验   与FMDV-A、FMDV-O、布鲁氏菌、BVDV阳性血清无交叉反应，特异性100%。

2.4.6 重复性试验  6份阴阳性血清批内/批间3次重复，变异系数<7.4%，重复性良好。

2.4.7 临床样品检测及符合率评估   54份已知背景血清 vs 商品竞争ELISA，总符合率92.59%（50/54），其中阳性符合率90.47%，阴性符合率100%，方法可靠，可直接用于临床监测（表 3）。

3 讨论

ORF002 为 LSDV 特异性膜蛋白，首次用于无活病毒间接 ELISA；相比 VNT 与竞争 ELISA，本法免病毒、成本低、通量高，适合基层监测；组织毒株变异可能影响单抗原检测灵敏度，后续可引入多表位嵌合抗原或结合中和试验复核。

4 结论
成功建立基于 ORF002 重组蛋白的间接 ELISA，敏感、特异、重复性好，与商品试剂盒符合率 >92 %，可直接用于 LSD 临床抗体检测及疫苗免疫效果评价，为我国 LSD 防控与净化提供新的技术支撑。

关键词：牛结节性皮肤病 ; ORF002 ; 原核表达 ; 间接ELISA