一种感染性变态反应性疾病，与溶血性链球菌有关。夏季雨水多，阴雨连绵时间长，大部分猪栏圈潮湿，是造成该病的重要因。1、症状该病主要受贼风，猪舍潮湿、寒冷因素影响。受害猪群表现腰硬如板，运动不灵活，初期黏着步样，缓慢短步，病情重时，四肢伸直不能站立，卧地不起，强行扶起，四肢及全身肌肉哆嗦，体温稍高，食欲减退。严重时，发出尖叫声。如早期治疗，较易于治愈。2、预防加强生猪饲养管理，严防风、寒、湿的侵袭，加大通风换气，及时清除圈内粪尿、污泥、浊水，保持地面干燥，清洁卫生。加厚垫草，防寒保暖，防止褥疮。3、治疗10％水杨酸钠注射液，或复方水杨酸钠注射液20毫升～50毫升，肌肉注射，每日1次，连注2次～3次。复方氨基比林注射液5毫升～10毫升，肌肉注射，每日1次，连注2次～3次。安乃近注射液1毫升～3毫升，肌肉注射，每日2次，连注2天。4、注意 猪急性肌肉风湿病与破伤风有些类似病状。破伤风有创伤史，神经兴奋性增高，四肢强拘，机能障碍不能随运动减轻，颈直尾腰，形如木马，水杨酸钠制剂不能缓解症状，应注意区别。

大家好，今天给大家分享一篇来自江苏省农科院在Vaccine发表的题为“Comparative study on the inactivation and immunogenicity of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis vaccines prepared using different inactivants”的文章。摘要  本研究旨在探究制备猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）和猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis）灭活疫苗的最佳灭活剂及其灭活条件。研究比较了甲醛、硫柳汞、β-丙内酯（BPL）及二乙烯亚胺（BEI）对支原体的灭活效果。结果表明，在37 °C条件下，使用0.01%甲醛作用24小时或0.02%甲醛作用12小时；0.0008%硫柳汞作用12小时；0.004% BEI作用24小时或0.5% BEI作用12小时，均可完全灭活猪肺炎支原体。在4 °C条件下，使用0.02% BPL作用24小时或0.1% BPL作用12小时，亦可实现完全灭活。对于猪鼻支原体，在37 °C条件下，使用0.01%甲醛作用24小时或0.02%甲醛作用12小时；0.004%硫柳汞作用24小时或0.02%硫柳汞作用12小时；0.004% BEI作用24小时或0.5% BEI作用12小时，均可完全灭活。在4 °C条件下，使用0.1% BPL作用12小时可实现完全灭活。随后通过免疫BALB/c小鼠评估了灭活后支原体的免疫原性。使用高剂量（每剂量10⁶ CCU）的各类灭活剂制备的两种支原体疫苗均能诱导小鼠产生高水平的血清IgG抗体。其中，甲醛灭活的猪肺炎支原体疫苗诱导的抗体滴度显著高于其他灭活剂组；而BEI灭活的猪鼻支原体疫苗诱导的抗体滴度显著高于硫柳汞灭活组。在低剂量（每剂量10⁴ CCU）免疫小鼠中，仅甲醛和BEI灭活的猪肺炎支原体疫苗，以及甲醛、BPL和BEI灭活的猪鼻支原体疫苗能诱导显著水平的血清IgG抗体。在这些组别中，甲醛灭活疫苗组产生的抗体水平均高于其他灭活剂组。本研究为猪肺炎支原体和猪鼻支原体灭活疫苗的大规模生产中的灭活工艺提供了可靠依据。关键词： β-丙内酯 二乙烯亚胺 甲醛 灭活 猪肺炎支原体 猪鼻支原体 硫柳汞1背景支原体属是猪病中最重要的细菌性病原体之一，可导致猪只慢性感染且难以从猪场根除。其中，猪肺炎支原体是猪地方流行性肺炎（EP）的关键病原体[1,2]。该呼吸道疾病呈全球性分布，对经济造成显著影响，主要临床症状为咳嗽伴生长性能下降。此外，猪肺炎支原体可通过增强病毒性病原体（如猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV和猪圆环病毒2型PCV2）所致呼吸道疾病的严重程度，参与猪呼吸道疾病综合征（PRDC）的发生[3]。猪鼻支原体在全球猪群中普遍存在，常定植于扁桃体及上呼吸道黏膜（包括鼻腔和传导气道）。多数携带猪鼻支原体的猪只无显著临床症状，因此该病原体曾被视为猪鼻腔正常菌群的组成部分。然而后续临床与科学研究证实了猪鼻支原体的致病性：它能引发严重的全身性感染，导致多发性浆膜炎、关节炎、耳炎、咽鼓管炎、结膜炎及流产等病症[4-8]；此外也可能参与PRDC的发生[9,10]。但导致其致病的具体机制或条件尚未明确。值得注意的是，猪鼻支原体还与人类胃癌、肺癌及结肠癌等恶性肿瘤存在关联[11,12]。疫苗接种是控制这两种病原体感染最有效的措施[1,2,4,5]。针对猪肺炎支原体的商业化疫苗主要包括灭活疫苗和活疫苗两大类：由全菌制剂与佐剂组成的灭活疫苗在全球广泛应用[13]，而减毒活疫苗仅在墨西哥和中国获批使用[14]。目前还有与PCV2联合的猪肺炎支原体二联灭活疫苗，或与格拉瑟菌（原名副猪嗜血杆菌）联合的灭活疫苗等商业化多联疫苗产品[13,15,16]。对于猪鼻支原体，目前仅有勃林格殷格翰生产的灭活疫苗获批上市。确保疫苗的安全性与有效性是疫苗研发过程中的核心目标。在灭活疫苗的生产中，病原体的完全灭活是消除感染风险、保证疫苗安全的关键环节。灭活效果与所选灭活剂密切相关：优良的灭活剂应在彻底灭活病原体的同时，保持其良好的抗原性。因此，筛选高效安全的灭活剂是开发灭活疫苗的重要步骤。目前用于支原体灭活的试剂包括甲醛、硫柳汞、β-丙内酯（BPL）及二元乙烯亚胺（BEI）等[17-21]，但这些灭活剂的效果差异尚不明确。本研究通过测定并比较甲醛、硫柳汞、BPL和BEI对猪肺炎支原体及猪鼻支原体的灭活效果，以及灭活后抗原的免疫原性，以确定生产这两种支原体灭活疫苗的最适灭活剂。2材料与方法2.1  支原体菌株与培养条件本实验所用猪肺炎支原体NJ株与猪鼻支原体HEF-16株分别分离自中国南京与合肥地区，均培养于KM2液体培养基[22]。支原体培养物滴度通过颜色变化单位（CCU）法进行测定，该方法以培养基中指示剂因酸度变化而显黄色作为判定依据。简要流程如下：使用KM2培养基将支原体培养物进行十倍系列稀释（至10⁻¹¹），置于37℃培养并持续观察两周。CCU滴度通过四次重复测定确定，按每毫升培养物表示为10^y（y为各重复组中因支原体生长导致培养基酸化的阳性管数的平均值）[23,24]。2.2  支原体灭活将支原体菌株于37°C条件下在KM2液体培养基中培养36至48小时。取10 mL支原体培养物，分别使用不同浓度的甲醛（美国Sigma）、硫柳汞（美国Sigma）、β-丙内酯（中国Macklin）及二元乙烯亚胺（美国Sigma）（见表1）进行处理以测试其灭活效果。将四种灭活剂按不同浓度加入支原体培养物中，并设置不添加任何灭活剂的对照组。经甲醛、硫柳汞或BEI处理的培养物置于37°C条件下作用[25-27]，而经BPL处理的培养物则在4°C下进行[28]。所有处理组分别作用12小时和24小时。此外，对于BEI处理组，在灭活作用结束后，加入无菌硫代硫酸钠溶液至终浓度为2%，以水解残留的BEI[29]。所有处理完成后，将支原体培养物置于4°C保存，以备后续使用。2.3  灭活后支原体活性检测为评估灭活处理后残留的支原体活性，分别于作用12小时或24小时后取1 mL培养物样本，于4°C条件下以12000g离心20分钟。沉淀物用1 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）重悬，随后通过颜色变化单位（CCU）法测定支原体滴度[19]。每日观察支原体培养物的颜色变化。若培养物颜色未发生改变，则按1:10的比例将其在KM2液体培养基中每7天传代一次，连续传代三代。若支原体培养物在三代传代过程中颜色均无变化，则判定为完全灭活。2.4  小鼠体内灭活支原体免疫原性评价根据灭活试验结果，选取各灭活剂所需的最低浓度与最短作用时间，用于制备猪肺炎支原体与猪鼻支原体疫苗。将灭活后的支原体培养物稀释至3.5 × 10⁷ CCU/mL或3.5 × 10⁵ CCU/mL，并与吐温-80（4 %, v/v）混合。随后，将水相与含有6% Span-80的Marcol白色矿物油佐剂按10:25 (v/v)的体积比进行乳化，制备成疫苗。选用6至8周龄雄性BALB/c小鼠（由中国扬州大学比较医学研究所提供），每组8只，经肌肉注射接种0.1 mL猪肺炎支原体或猪鼻支原体疫苗（每剂量含10⁶ CCU或10⁴ CCU）。以接种PBS的小鼠作为阴性对照组。初次免疫后第14天进行加强免疫。2.5  疫苗免疫诱导血清抗体的检测分别于二次免疫后第0、7、14、21天（接种剂量为10⁶ CCU组）以及第0、14、28、42天（接种剂量为10⁴ CCU组）采集小鼠血清样本。采用实验室建立的间接ELISA方法检测针对猪肺炎支原体或猪鼻支原体的抗体。简要步骤如下：通过12000 ×g离心20分钟收集猪肺炎支原体或猪鼻支原体菌体，沉淀经PBS洗涤三次并重悬。超声破碎裂解后，收集上清液，并使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（中国，碧云天）测定其蛋白浓度。将上清用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液（pH 9.6）稀释至5 μg/mL，包被96孔ELISA板，4°C孵育过夜。用5%牛血清白蛋白（BSA，中国，碧云天）封闭后，每孔加入100 μL血清样本（1:100稀释于含5% BSA的PBS中），37°C孵育30分钟。随后加入100 μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（中国，博士德；1:10,000稀释于含5% BSA的PBS中）。洗涤后，加入四甲基联苯胺-过氧化氢底物溶液（TMB，中国，碧云天），25°C避光孵育10分钟以显色。最后使用BioTek uQuant酶标仪（美国，Bio-Tek）于450 nm波长下测定溶液的光密度值。2.6  统计分析实验数据均以均值±标准差（SD）表示。采用GraphPad Prism软件（8.2.1版）进行统计分析。组间抗体水平差异采用重复测量方差分析进行检验，将p 3结果3.1  不同灭活剂对猪肺炎支原体的作用效果将不同浓度的灭活剂加入猪肺炎支原体培养物中，于37°C（BPL在4°C）条件下分别作用12小时或24小时。结果如图1所示，随着灭活剂浓度的增加，作用12小时或24小时后猪肺炎支原体培养物的滴度（CCU/mL）逐渐降低。四种灭活剂均能实现完全灭活：甲醛在0.01%浓度下作用24小时、0.02%浓度下作用12小时可实现完全灭活；硫柳汞在0.0008%浓度下作用12小时即可完全灭活猪肺炎支原体；BPL在0.02%浓度下作用24小时、0.1%浓度下作用12小时可实现完全灭活；BEI则在0.004%浓度下作用24小时、0.5%浓度下作用12小时达到完全灭活。基于图1结果可知，与其他灭活剂相比，硫柳汞所需完全灭活猪肺炎支原体的浓度最低（0.0008%）。3.2  不同灭活剂对猪鼻支原体的作用效果采用与猪肺炎支原体灭活方案相似的流程，将不同浓度灭活剂加入猪鼻支原体培养物中，于37°C（BPL在4°C）条件下分别作用12小时或24小时。结果如图2所示，随着灭活剂浓度增加，作用12或24小时后猪鼻支原体培养物滴度（CCU/mL）呈现逐步下降趋势。四种灭活剂均能实现完全灭活：甲醛在0.01%浓度作用24小时、0.02%浓度作用12小时可实现完全灭活；硫柳汞在0.004%浓度作用24小时、0.02%浓度作用12小时可完全灭活猪鼻支原体；BPL在0.1%浓度作用12小时即达到完全灭活；BEI则在0.004%浓度作用24小时、0.5%浓度作用12小时实现完全灭活。观察发现，在24小时作用条件下，硫柳汞（0.004%）与BEI（0.004%）完全灭活猪鼻支原体所需的最低浓度均低于甲醛（0.01%）和BPL（0.1%）。然而当灭活时间缩短至12小时时，BEI所需的最低灭活浓度显著升高。3.3  灭活猪肺炎支原体与猪鼻支原体在小鼠体内的免疫原性评价基于上述结果，分别采用经证实有效的最低浓度和最短作用时间的不同灭活剂对猪肺炎支原体与猪鼻支原体进行灭活（猪肺炎支原体：0.01% 甲醛与 0.004% BEI 于 37°C 作用 24 小时，0.0008% 硫柳汞于 37°C 作用 12 小时，以及 0.02% BPL 于 4°C 作用 24 小时；猪鼻支原体：0.01% 甲醛、0.004% 硫柳汞与 0.004% BEI 于 37°C 作用 24 小时，以及 0.1% BPL 于 4°C 作用 12 小时）。随后制备了高剂量（每剂量 10^6 CCU 猪肺炎支原体或猪鼻支原体）和低剂量（每剂量 10^4 CCU 猪肺炎支原体或猪鼻支原体）的灭活疫苗，并用于免疫 BALB/c 小鼠。针对猪肺炎支原体疫苗，所有接种高剂量抗原的小鼠在第二次免疫后第 7 天均产生了显著水平的血清 IgG 抗体（p < 0.05；表 2）。其中，接种甲醛灭活疫苗的小鼠，其抗体水平显著高于接种其他灭活剂所制备疫苗的小鼠（p < 0.05；表 2）。在接种低剂量抗原的小鼠中，仅接收甲醛或 BEI 灭活疫苗的小鼠与对照组小鼠相比，抗体水平显示出显著差异（p < 0.05）。甲醛组的 IgG 水平高于 BEI 组（p < 0.05）。与对照组相比，接种硫柳汞或 BPL 灭活疫苗的小鼠未表现出抗体水平的显著升高（p > 0.05）。针对猪鼻支原体疫苗，所有接种高剂量抗原的小鼠在第二次免疫后第 7 天均产生了显著水平的血清 IgG 抗体（p < 0.05；表 3）。其中，接种 BEI 灭活疫苗的小鼠，其抗体水平显著高于接种硫柳汞灭活疫苗的小鼠（p < 0.05；表 3）。在接种低剂量抗原的小鼠中，接种甲醛、BPL 或 BEI 灭活疫苗的小鼠，其抗体水平与对照组和硫柳汞组小鼠相比存在显著差异（p < 0.05）。然而，接种甲醛、BPL 和 BEI 灭活疫苗的各组小鼠之间，其抗体水平无显著差异（p > 0.05）。与对照组相比，接种硫柳汞灭活疫苗的小鼠未表现出抗体水平的显著升高（p > 0.05）。4讨论基于其抗真菌与抗腐蚀特性，硫柳汞对真菌、细菌及病毒均具有一定的灭活作用，并广泛应用于多种人用及兽用疫苗中[30,31]。BPL通过影响微生物的DNA或RNA结构实现灭活[32,33]。BEI是乙烯亚胺的衍生物，它能在不破坏病毒衣壳蛋白的前提下消除病毒的感染性[4,11]。甲醛是应用最为广泛的传统灭活剂之一；经甲醛处理后，细菌或病毒因蛋白质和核酸发生烷基化而丧失感染能力。近年来，制备支原体灭活疫苗最常用的灭活剂主要为甲醛与BEI。 例如，丝状支原体丝状亚种采用0.7%甲醛灭活[17]，肺炎支原体采用0.16%甲醛灭活[18]，猪鼻支原体采用0.2%甲醛[20]或BEI[5,29]灭活，滑液囊支原体则采用BEI灭活[21]。在本研究中，我们使用甲醛、硫柳汞、BPL和BEI对猪肺炎支原体与猪鼻支原体进行灭活并比较了其效果。 结果显示，经0.004% BEI于37°C处理24小时，或0.5% BEI处理12小时，可完全灭活猪肺炎支原体与猪鼻支原体。该发现与Gerald等人的研究结果一致，他们曾报道0.001 M（0.0067%）BEI可完全灭活猪鼻支原体[29]。Selwyn等学者发现，在含有0.2%甲醛和0.1% BPL的支原体培养基中，于室温下作用3至24小时，可完全灭活所检测的22种支原体[19]。我们的结果表明，0.02%与0.1%的BPL分别能完全灭活猪肺炎支原体与猪鼻支原体，而0.01%的甲醛则对这两种支原体均能完全灭活。本研究确定的甲醛最适灭活浓度，相对低于Selwyn等人[19]和Wei等人[20]报告中所用的浓度。 这很可能是因为他们选择了灭活细菌或支原体的常用甲醛浓度，该浓度高于灭活猪肺炎支原体与猪鼻支原体所需的最低浓度。诸多研究致力于探索用于生产支原体灭活疫苗的新型灭活剂。 Hazem等人报道了一种利用1,5-碘萘基叠氮化物（INA）灭活鸡毒支原体的创新方法[34]。该研究表明，这种疏水性的光诱导烷化剂INA能够灭活鸡毒支原体，同时保留其表面脂蛋白，因此有望发展成为一种用于支原体疫苗研发的通用灭活策略。免疫原性是疫苗的核心属性；然而，灭活处理可能导致免疫原性受到一定损伤。 通常，灭活剂会破坏细菌或病毒的核酸或蛋白质，导致抗原的完整性不如未处理的抗原。少数研究表明，传统灭活剂甲醛会对抗原造成一定损伤。在Martin等人的一项研究中，通过添加0.7%（体积比）甲醛或56°C水浴热灭活30分钟来处理丝状支原体丝状亚种培养物，并采用补体结合试验检测疫苗接种后的抗体应答。结果显示，甲醛灭活疫苗接种组中观察到抗体应答的动物比例为5/7（71%），低于热灭活组的9/9（99%）[17]。José等人采用0.1%（体积比）BPL对流感病毒进行灭活，然而该处理严重影响了病毒的血凝活性和融合能力，表明其表面抗原受到了一定损伤[35]。硫柳汞自1927年开发以来，一直并被继续用作某些化妆品、局部用药和生物制品（包括疫苗）的防腐剂。 直到本世纪初，美国所有含破伤风成分的疫苗均含有硫柳汞，其中许多浓度为0.01%。但随着越来越多证据揭示硫柳汞对人体（尤其是婴幼儿）存在不良影响[36]，其在疫苗中的使用随之减少。此外，研究亦报道了硫柳汞对疫苗抗原存在损害效应，这可能降低疫苗效力[36,37]。因此，针对特定疫苗探索适宜的灭活剂以及最优的灭活时间与温度至关重要。 一般而言，随着灭活剂浓度和作用温度的升高，灭活效率会随之提升，所需的灭活时间则相应缩短。一种优良的灭活剂应能在低浓度、短时间和低温条件下有效灭活病原体，同时确保疫苗的安全性与效力。在本研究中，我们综合考量了浓度与作用时间等因素，以优化四种不同灭活剂的灭活条件。通过小鼠免疫实验评估了灭活处理对抗原免疫原性的影响。就猪肺炎支原体而言，甲醛被视为最佳灭活剂， 因为在高剂量和低剂量免疫实验中，该组小鼠的抗体水平均显著高于其他各组。此外，在低剂量免疫实验中，BEI组的抗体水平也显著高于硫柳汞组和BPL组。对于猪鼻支原体，最佳灭活剂为甲醛，其次为BPL和BEI。 这三组小鼠均产生了显著水平的抗体，且组间无统计学差异；但在低剂量免疫实验中，甲醛组小鼠的抗体水平略高于BPL组和BEI组。硫柳汞被认为不适用，因为在低剂量免疫实验中，硫柳汞组未检测到抗体。本研究发现，在维持猪肺炎支原体与猪鼻支原体的免疫原性方面，甲醛灭活法更具优势。 这似乎与Martin等人关于丝状支原体丝状亚种的研究结果（提示甲醛对抗原存在一定损伤[17]）不一致。该差异可能是由于本研究使用的甲醛浓度（0.01%）低于其报告中使用的浓度（0.7%）所致。我们的数据表明，甲醛是开发抗猪肺炎支原体与猪鼻支原体联合疫苗的一种适宜灭活剂。值得注意的是，在高剂量免疫实验中，不同灭活剂所致的免疫原性损伤差异并不显著。 这是因为当抗原剂量足够高时，疫苗仍能有效刺激免疫系统并诱导强烈的免疫应答。然而，在抗原剂量不足时，免疫原性的差异便得以充分显现。因此，选用适宜的灭活剂有助于降低所需抗原量，从而助力疫苗生产商降低生产成本。本研究数据为制备抗猪肺炎支原体与猪鼻支原体的单一或联合疫苗提供了参考依据。尽管小鼠常被用作猪用疫苗研究的替代模型[38,39]，但需注意二者之间仍存在一定差异。因此，经甲醛灭活的猪肺炎支原体与猪鼻支原体疫苗的免疫效力，尚需在猪体中进行进一步验证。5结论本研究比较了四种灭活剂对猪肺炎支原体与猪鼻支原体的灭活效果， 确定了各灭活剂的最佳作用浓度与时间。随后，通过以BALB/c小鼠为模型进行免疫，评估了灭活后支原体的免疫原性。研究结果显示，0.01%甲醛在37°C条件下作用24小时可完全灭活两种支原体。接种甲醛灭活疫苗的小鼠，其抗体水平均高于其他三种灭活剂制备的疫苗组，这表明甲醛是这两种支原体最适宜的灭活剂。

针对猪场出现的神经症状，合理选择能透过血脑屏障的抗生素是关键。这通常意味着猪可能患有细菌性脑膜炎，最常见的病原是猪链球菌，其能破坏血脑屏障。以下是常用药物、治疗方案及配伍的详细指南。一、核心治疗药物选择治疗细菌性脑膜炎，需选用能有效透过血脑屏障的药物。根据穿透能力和抗菌谱，可分为以下两类：二、针对神经症状的治疗方案与配伍出现神经症状时，治疗需 “抗菌”与“对症”相结合，并注意药物间的协同与禁忌。1. 核心抗菌治疗方案确诊或高度怀疑为细菌性脑膜炎（如猪链球菌脑膜炎型）时，可参考以下方案：重症脑膜炎首选组合：头孢噻呋（5mg/kg，每日1次） + 磺胺嘧啶钠（首次剂量加倍，20mg/kg）。此方案利用了头孢噻呋的强效杀菌和磺胺的高屏障穿透力，是有效的紧急处置方案。经典替代方案：复方磺胺嘧啶钠注射液（含甲氧苄啶）单独肌肉注射，首次加倍。或使用阿莫西林/克拉维酸（20mg/kg，每日2次）联合恩诺沙星（5mg/kg）。针对混合感染：若伴有严重呼吸道症状，疑为副猪嗜血杆菌等混合感染，可考虑氟苯尼考+替米考星的“呼吸道”组合，但此方案主要用于呼吸道，治疗脑膜炎时需评估磺胺或头孢的联合使用。2. 辅助对症治疗药物控制症状、降低颅内压和神经保护同等重要：降低颅内压：使用甘露醇（1g/kg）静脉注射，可快速缓解脑水肿。抗炎与抗休克：短期使用地塞米松（0.2mg/kg），有助于抑制炎症、稳定血脑屏障。解热镇痛：高热时（>41℃）可使用氟尼辛葡甲胺或安痛定。神经营养：补充维生素B1（10mg/kg）有助于修复神经髓鞘。3. 关键配伍禁忌与注意事项氟苯尼考的禁忌：禁止与β-内酰胺类（阿莫西林、青霉素、头孢类）合用，会产生拮抗，药效降低；避免与喹诺酮类（恩诺沙星）合用，可能增加毒性或导致肠道功能紊乱；也不能与林可霉素、碱性药物（小苏打）混合使用。磺胺类的禁忌：体外混合时，避免与头孢菌素、青霉素类等混合，可能发生理化反应。青霉素类的注意：与氯霉素、磺胺类、四环素类合用可能干扰其杀菌活性，需谨慎。三、治疗原则与流程精准诊断：神经症状也可能由伪狂犬病、大肠杆菌毒素等疾病引起，务必鉴别诊断。及时与足量：一旦确诊细菌性脑膜炎，立即使用穿透力强的药物，首次剂量建议加倍，以确保脑脊液中迅速达到有效浓度。疗程完整：抗生素治疗需持续至少3-5天，即使症状缓解也不可过早停药，以防复发或产生耐药性。综合护理：将病猪隔离在安静、黑暗的环境中，减少刺激。对于不能采食的猪，需进行静脉补液或灌服水料，以维持营养和电解质平衡。

母猪在饲养中，由于种种原因，常出现不发情的现象。特别是一些初次饲养母猪户，母猪出现不发情的比例较高。笔者对部分饲养户的后备母猪达到性成熟月龄还不发情现象进行了分析，主要原因是后备母猪先天性生殖器发育不良，饲养管理不当、营养缺乏、体况过肥等。采取以下方法进行防治：对先天性生殖器官发育不良的或畸形予以淘汰；饲养管理不当导致营养缺乏的增加日粮中蛋白质、维生素、矿物质等营养，对体况过肥的采取减料或增加粗饲料、多喂青绿多汁饲料，重新编栏并栏等，同时每天用公猪试情2~3次，每次5~10分钟。没有饲喂公猪优势的散养户可以借助公猪气味剂，采取上述措施大多数母猪可出现发情。对仍不发情母猪笔者采取中西药治疗，共治疗26例，治愈22例，治愈率达84.6%。治疗方法：1 中药治疗 治宜活血调经，暖宫催情，滋阴补肾，通调经络，促进排卵。促进动物垂体前叶释放促黄体素（LH)、促卵泡素（FSH)，标本兼治。处方：当归10g，熟地10g，赤芍10g，阳起石8g，枸杞5g，香附15g，益母草10g，淫羊藿10g。共研末，每头每天50g，混合加入饲料喂服，连续5天。2 西药治疗 饲喂中药第三天肌注 PG600 2支，继续饲喂两天。通过上述治疗母猪7天左右开始发情，若还不发情应予以淘汰。

生猪养殖在我国畜牧业中占据重要地位，是保障肉类供应和农民增收的重要产业。基层生猪养殖作为生猪养殖的基础环节，其防疫与检疫工作的质量直接影响到整个生猪养殖产业的发展，然而，目前基层生猪养殖中防疫与检疫工作仍存在一些问题，如防疫意识淡薄、检疫技术落后、协同管理不足等，这些问题制约了基层生猪养殖的健康发展，因此，加强基层生猪养殖中防疫与检疫的协同管理具有重要的现实意义。本文旨在探讨基层生猪养殖中防疫与检疫的协同管理，分析当前防疫与检疫工作存在的问题，提出协同管理的策略和措施，以期为基层生猪养殖的健康发展提供参考。1 基层生猪养殖防疫与检疫工作的重要性1.1 保障生猪健康生长有效的防疫措施可以预防生猪疫病的发生，降低疫病传播风险，为生猪提供一个健康的生长环境，而检疫工作能够及时发现患病生猪，采取相应的隔离、治疗或无害化处理措施，防止疫病的扩散，保障生猪群体的健康，如通过定期的疫苗接种和严格的卫生消毒，可以有效预防猪瘟、猪口蹄疫等重大疫病的发生；通过产地检疫和屠宰检疫，可以及时发现并处理患病生猪，避免其进入市场流通。1.2 维护养殖户经济利益生猪疫病的暴发往往会给养殖户带来巨大的经济损失，如生猪死亡、治疗费用增加、市场销售受阻等。做好防疫与检疫工作，可以降低疫病发生的概率，减少经济损失；同时，通过检疫合格的生猪和猪肉产品更容易获得市场认可，价格也相对较高，能够提高养殖户的经济效益。1.3 确保食品安全猪肉是人们日常生活中重要的肉类食品之一，其质量安全直接关系到消费者的身体健康，防疫与检疫工作可以从源头把控猪肉的质量安全，防止患病生猪和不合格猪肉产品流入市场，保障消费者的饮食安全。2 基层生猪养殖防疫与检疫工作存在的问题2.1 防疫意识淡薄部分养殖户对防疫工作的重要性认识不足，缺乏科学的养殖观念和防疫知识，他们往往忽视养殖环境的卫生消毒，不按时进行疫苗接种，甚至在生猪出现疫病症状时也不及时采取措施，导致疫病的传播和扩散。2.2 检疫技术落后基层检疫机构的检疫设备和技术相对落后，难以满足现代检疫工作的需求，一些检疫人员缺乏专业的培训，技术水平不高，对疫病的诊断和检测能力有限。在实际检疫工作中，仍然采用传统的感官检查方法，对于一些隐性感染和新型疫病难以准确检测；同时，检疫信息化建设滞后，信息共享困难，也影响了检疫工作的效率和质量。2.3 协同管理不足防疫与检疫工作涉及多个部门和环节，但目前各部门之间的协同配合不够紧密，存在职责不清、沟通不畅等问题，如动物疫病预防控制中心负责防疫工作，动物卫生监督所负责检疫工作，但在实际工作中，两者之间缺乏有效的协作机制，导致防疫与检疫工作脱节；此外，养殖户、养殖场、屠宰场等与防疫检疫部门之间的信息交流也不够顺畅，影响了工作的顺利开展。2.4 资金投入不足基层生猪养殖防疫与检疫工作需要大量的资金投入，包括疫苗采购、设备购置、人员培训等，然而，由于地方财政有限，对防疫与检疫工作的资金支持不足，导致防疫设备老化、检疫手段落后、人员待遇不高，影响了工作人员的积极性和工作质量。一些养殖户也因资金紧张，无法按照要求进行防疫和检疫工作。3 基层生猪养殖防疫与检疫协同管理的策略3.1 加强宣传教育，提高防疫意识通过举办培训班、发放宣传资料、现场指导等方式，向养殖户宣传生猪养殖防疫与检疫的重要性和相关知识，提高他们的防疫意识和科学养殖水平，如定期组织养殖户参加防疫知识培训，邀请专家讲解疫病的预防和控制方法；发放《生猪养殖防疫手册》等宣传资料，让养殖户了解疫苗接种、卫生消毒等防疫措施的具体操作方法。同时，通过典型案例的宣传，让养殖户认识到防疫与检疫工作不到位的危害，增强他们的责任感和自觉性。3.2 提升检疫技术水平加大对基层检疫机构的资金投入，更新检疫设备，引进先进的检疫技术，如分子生物学检测技术、免疫学检测技术等，提高疫病检测的准确性和效率；加强对检疫人员的培训，定期组织业务培训和技术交流活动，邀请专家进行授课和指导，提高检疫人员的专业素质和技术水平；建立检疫人员考核机制，对表现优秀的人员给予奖励，对不符合要求的人员进行培训或调整岗位。3.3 完善协同管理机制建立健全防疫与检疫工作的协同管理机制，明确各部门的职责和分工，加强部门之间的沟通与协作，防疫部门、检疫部门、市场监管部门等应建立联合工作机制，定期召开联席会议，共同研究解决防疫与检疫工作中存在的问题。加强信息共享，建立防疫与检疫信息管理平台，实现养殖户、养殖场、屠宰场、检疫机构等之间的信息互联互通，提高工作效率。3.4 加大资金投入政府应加大对基层生猪养殖防疫与检疫工作的资金投入，设立专项经费，用于疫苗采购、设备购置、人员培训、疫情监测等方面。同时，鼓励社会资本参与生猪养殖防疫与检疫工作，通过政府与社会资本合作等模式，拓宽资金来源渠道；此外，对积极开展防疫与检疫工作的养殖户和企业给予一定的补贴和奖励，提高他们的积极性。4 基层生猪养殖防疫与检疫协同管理的具体措施4.1 建立健全防疫体系制定完善的防疫制度，包括卫生消毒制度、疫苗接种制度、疫病监测制度等，要求养殖户严格按照制度进行防疫工作；加强养殖环境的管理，定期对养殖场进行清洁和消毒，保持养殖环境的卫生；合理规划养殖场的布局，设置隔离区和无害化处理设施，防止疫病的传播。4.2 强化产地检疫和屠宰检疫严格执行产地检疫申报制度，养殖户在生猪出栏前必须提前向当地检疫机构申报检疫，检疫人员按照检疫规程，对生猪进行临床检查、免疫记录查验等，合格后方可出具检疫证明。加强屠宰检疫工作，屠宰场必须凭产地检疫证明接收生猪，并在屠宰过程中严格按照检疫标准进行检疫，对检疫不合格的生猪和猪肉产品，要进行无害化处理，严禁流入市场，如建立产地检疫和屠宰检疫追溯体系，通过信息化手段，实现对生猪从养殖到屠宰全过程的追溯管理。4.3 加强疫情监测与预警建立健全疫情监测网络，加强对生猪养殖场、屠宰场、交易市场等重点场所的疫情监测；定期采集生猪样品进行检测，及时掌握疫病流行态势；建立疫情预警机制，当发现疫情或疫病流行趋势时，及时发布预警信息，采取相应的防控措施，防止疫情的扩散，如利用大数据分析技术，对疫情监测数据进行分析和预测，提前做好防控准备。4.4 推进病死猪无害化处理加强对病死猪无害化处理的监管，建立病死猪无害化处理长效机制；鼓励养殖户和养殖场建设无害化处理设施，对病死猪进行自行无害化处理；同时，建立病死猪收集和运输体系，对无法自行处理的病死猪，由专业的收集和运输队伍进行集中处理；加强对病死猪无害化处理过程的监督，确保处理符合环保和卫生要求，防止病死猪流入市场。5 结论基层生猪养殖中防疫与检疫的协同管理是保障生猪健康生长、维护养殖户经济利益、确保食品安全的关键，针对当前防疫与检疫工作存在的问题，通过加强宣传教育、提升检疫技术水平、完善协同管理机制、加大资金投入等策略，以及建立健全防疫体系、强化产地检疫和屠宰检疫、加强疫情监测与预警、推进病死猪无害化处理等具体措施，可以有效提高基层生猪养殖防疫与检疫工作的质量和效率，促进基层生猪养殖的健康发展。在未来的工作中，还需要不断总结经验，持续改进和完善防疫与检疫协同管理工作，以适应不断变化的市场需求和疫病防控形势。

【编者按】近日，一条令人扼腕的消息在养殖圈炸开了锅：备受期待的非洲猪瘟重组毒株疫苗研发，被权威机构正式宣告失败。 这一消息，无疑给期盼“疫苗救市”的养猪人泼了一盆冷水。2025年12月，国内顶尖科研团队发布了一项让全行业心凉的研究结果：针对当前流行的非瘟重组毒株研发的基因缺失疫苗，无法完全提供有效保护。自2018年非洲猪瘟病毒传入我国，这场疫病已困扰养猪业多年，造成巨大产能波动与经济损失。近期周边疫情形势依旧严峻，越南等地疫情持续蔓延，我国香港在2025年更是多次发现疫情，从年初元朗三家猪场销毁超6000头猪，到12月流浮山猪场检出阳性后扑杀978头，跨境传播风险持续攀升，“外防输入、内防反弹”压力始终未减，一款安全有效的疫苗成为千万养猪人的迫切期盼。科研领域传来诊断技术突破的好消息，2025年11月1日，华中农业大学动物医学学院教授何启盖和李文涛团队研究成果在《农业科学学报（英文）》(Journal of Integrative Agriculture，JIA)在线发表。该团队以灭活非洲猪瘟病毒为免疫原，成功制备5株靶向p72蛋白的特异性单克隆抗体，精准定位到p72蛋白第130–152位氨基酸的新型保守线性B细胞表位。这一表位能被抗体高效识别，且与感染后阳性血清反应强烈，为开发更灵敏精准的诊断工具奠定基础，助力更早发现感染、阻断传播。疫苗研发却遭遇挫折，非洲猪瘟病毒基因组庞大且变异频繁，当前I/II型重组毒株成为流行主力。2025年12月，上海兽医研究所、中国农业大学等单位联合研究显示，以重组毒株ASFV-HN为亲本构建的两株基因缺失苗，均未能实现完全保护。其中一株无法有效致弱，另一株致弱后免疫猪，在遭遇同源或异源毒株攻毒时，仍出现发烧、排毒甚至死亡现象，证实重组毒株疫苗的交叉保护力与安全性仍未突破关键瓶颈。2025年国内养猪业损失惨重，好在2026年行业曙光初现，市场逐步趋向平稳，非洲猪瘟防控仍是产业稳定的核心。在有效疫苗尚未问世的当下，非洲猪瘟防控是一场需要持之以恒、细致入微的持久战。它没有旁观者，每一个环节的疏漏都可能带来损失。对于广大养殖户而言，严格落实日常生物安全措施，保持与防疫部门的密切沟通，出现异常情况立即上报，是守护劳动成果、保障猪场平稳运行的根本。

随着寒潮频频来袭，全国各地猪场再次绷紧了神经。冬季不仅是呼吸道疾病和腹泻的高发季，更是非洲猪瘟防控压力陡增的“高危期”。对于养猪人而言，深刻理解冬季非洲猪瘟的发病规律，并有针对性地筑牢防线，是决定猪场能否平稳过冬、甚至能否继续生存的关键战役。一、冬季非洲猪瘟的“高发”规律与深层原因冬季非洲猪瘟防控形势严峻，并非偶然，而是由病毒特性、猪群状态和环境管理挑战共同决定的。1.病毒特性：低温下的“持久战”非洲猪瘟病毒对环境有极强的抵抗力，而低温环境进一步延长了其存活时间。研究表明，在寒冷条件下，病毒在粪便、土壤、木材等有机物中可存活更久。这意味着，冬季一旦发生污染，病毒在猪场周边环境中持续存在的风险更高，形成长期隐患。同时，病毒的传播途径并未改变，健康猪只接触病猪、其分泌物、排泄物，或被污染的饲料、水源、车辆、人员等，均可能感染。2.猪群状态：抵抗力下降的“脆弱期”冬季持续的冷应激对猪群是巨大的消耗。为维持体温，猪只需要调动大量能量，导致用于免疫系统的营养资源相对不足，整体抵抗力下降，处于更易感的“亚健康”状态。此外，冬季猪舍为了保温，普遍采取封闭措施，若通风不良，舍内氨气、粉尘等有害物质浓度升高，会持续损害猪只的呼吸道黏膜屏障，进一步削弱其局部免疫力。3.环境与管理：矛盾与漏洞的“集中期”冬季猪场管理面临“保温”与“通风”的根本矛盾。过度密闭虽保住了温度，却牺牲了空气质量，为病原滋生创造了条件。同时，低温给日常的清洗消毒工作带来了实际困难，例如消毒池结冰、消毒剂在低温下效果打折，若管理松懈，极易留下死角。此外，冬季是猪肉消费和调运的旺季，年节前后的腌腊等活动增加了猪肉流通和人员往来，间接抬高了病原传入风险。二、养猪人的冬季防范“作战图”面对以上规律，养猪人不能仅凭经验，必须采取系统性、针对性更强的防控策略。中国动物疫病预防控制中心发布的《中小规模场户非洲猪瘟防控“八要八不要”》提供了清晰、可操作的行动纲领。结合冬季特点，防范措施应聚焦以下核心环节：1.严控传入风险：守好大门是第一要务引种与购猪：坚持“自繁自养”是上策。如必须引种，则要对购入的仔猪进行严格隔离观察，确认健康后方可混群饲养。绝对禁止购入来源不明、未经检疫的生猪，尤其不要从流动猪贩手中买猪。饲料与饮水：必须使用干燥、清洁、无污染的饲料，及时清理料槽，防止霉变。坚决杜绝使用餐厨剩余物（泔水）喂猪，这是极其危险的行为。人员与车辆：严格执行进场人员和车辆的洗消流程。特别要严禁生猪贩运人、业务员等外来人员直接进入猪舍。冬季可考虑一次性采购足量物资，减少进场频次。2.强化内部管理：筑牢场内生物安全猪群巡查与隔离：加强日常巡查频次，一旦发现精神沉郁、体温升高（可达42℃）、皮肤发红或出血、呕吐、便秘或腹泻带血等异常猪只，必须立即隔离并上报，绝不能与健康猪混养。环境清洁与消毒：保持圈舍清洁、干燥，及时清理粪便和积水。冬季消毒要讲究科学：选择在气温相对较高的中午进行；可选用低温下仍有效的消毒剂（如碘制剂、氯制剂），或在消毒液中添加防冻剂防止结冰；消毒前务必彻底清洗，确保效果。要适当增加消毒频次，杜绝不消毒或敷衍了事。病死猪处理：对病死猪必须第一时间报告，并进行严格的无害化处理。严禁出售或随意丢弃，以防疫情扩散。3.提升猪群非特异性抵抗力做好基础免疫：按程序做好猪瘟、伪狂犬等常见疫病的免疫，提升猪群基础健康水平。保障营养与舒适度：在冬季，可通过在饲料中适当增加能量、补充维生素和微生态制剂等方式，帮助猪群抗应激。同时，要平衡好保温和通风，在产房、保育舍可使用保温灯、垫板等局部升温措施，并利用变频通风等技术手段，在维持温度的同时改善空气质量。为了更直观地掌握核心防控要点，下表总结了冬季管理中的关键行动与禁忌：三、构建长期稳固的防范体系除了具体的“要”与“不要”，养猪人还应从更高维度构建防控体系。这包括：对猪场进行科学的生物安全分区管理（生活区、生产区分离），设置出猪台，严格管控人、车、物流动。同时，要清醒认识到，目前我国尚未批准任何商业化的非洲猪瘟疫苗，市场上所谓的“走私苗”、“黑市苗”不仅无效，其本身可能就是毒源，会导致病毒在猪场持续存在和扩散，危害巨大，必须坚决抵制。总而言之，冬季非洲猪瘟的防控是一场没有捷径的硬仗。它考验的不是单点的技术，而是养猪人系统性的生物安全思维和毫不松懈的执行力。唯有将“御病毒于场外，灭隐患于萌芽”的理念贯穿于每一个生产细节，方能在严寒的冬季，为猪场筑起一道真正的“防火墙”，守护好来之不易的生产成果。

研究背景与目的PCV2、PCV3 广泛流行，PCV4 2019 年在中国出现，三者常混合感染，现有检测方法通量低。PCV 相关疾病年损失数十亿元，无特效药，早期精准诊断是防控关键。本研究旨在建立“单管同步”检测 PCV2/3/4 的三重荧光定量 PCR，并完成 Cap 基因分子流行病学与变异分析，为疫苗和诊断提供技术支撑。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 病毒和样本来源    疫苗对照：PRV、PRRSV、CSFV、TGEV/PEDV/PRoV 三联活疫苗（均经国标验证）。 临床样本：山东 441 份疑似 PCV 阳性组织/血清。1.1.2 主要试剂及仪器   核酸提取：Viral DNA/RNA Mini Kit；qPCR：ALLReady qPCR Mix、Turbo16P 仪；质粒构建：pUC57-DH5α 系统。1.2 方法1.2.1 引物设计与合成  PCV2/3 选保守 Rep 基因，PCV4 选型特异 Cap 基因；分别设计 TaqMan 探针（FAM-PCV2、VIC-PCV3、CY5-PCV4）。对照引物：另行设计 Cap 基因全长扩增引物，用于测序与进化分析。1.2.2 标准质粒的构建   合成 PCV2-Rep、PCV3-Rep、PCV4-Cap 片段 → 克隆至 pUC57 → 测序验证 → 计算拷贝数，109 copies·μL-1 分装。1.2.3 反应条件的优化  20 μL 体系正交试验：引物 0.4 μL、探针 0.2 μL、退火 60 ℃ 时 Ct 最低、荧光最强，定为最佳。1.2.4 标准曲线的建立  10 倍梯度稀释（108→102）混合质粒作模板，三重 qPCR 扩增；log(拷贝数) 对 Ct 作图，R² 均 >0.979。1.2.5 特异性试验  仅阳性质粒出现典型扩增曲线，其他猪病毒无交叉，证明三重体系高度特异。1.2.6 敏感性试验  下限一致达到 109 copies·μL-1，且呈良好倍比线性。1.2.7 重复性试验   批内/批间 CV 均 1.2.8 临床样品检测   441 份样本：三重 qPCR 检出 PCV2 163、PCV3 96、PCV4 4、混合 32 份；普通 PCR 复检阳性率显著降低，显示新方法的灵敏度优势。 1.2.9 PCV2、PCV3 Cap 基因遗传进化分析  阳性样品 Cap 基因扩增测序：获得 PCV2 34 条（2a/2b/2d）、PCV3 7 条（均为 3a）。与 59 株 PCV2、62 株 PCV3 参考序列构建系统树，明确国内优势基因型为 PCV2d 与 PCV3a。1.2.10 PCV4 Rep、Cap 基因遗传进化分析  收集 69 条 2019-2024 全球 PCV4 全基因组，划分 PCV4a/4b 两大群；发现 Cap-28R/G 与河南/河北株相关，可视为北方流行标记。2 结果2.1 最佳条件60 ℃ 退火，20 μL 体系，探针 0.2 μL。2.2 标准曲线线性范围 102~108 copies，R²≥0.979（图2）。2.3~2.5 特异性、敏感性、重复性均达标。2.6 临床总阳性率 67 %，混合感染 7.3%，远高于常规 PCR。2.7~2.9 遗传变异  PCV2 Cap 相似性 96.7%~99.7%，发现 5 个高频氨基酸突变热点；PCV3 Cap 相似性 97.2~99.9 %，山东株 27aa 保守；PCV4 Rep 7 个、Cap 5 个高频突变位点，Cap-27/28 可能是分型关键（图3、4）。3 讨论三重 TaqMan 法单管同步检测，省去 MGB 高成本，性价比更优。PCV2d 取代 2b 成为优势型，Cap-59、190、191 位变异可能影响疫苗保护，需持续监测。PCV3a 主导且关键表位稳定，为疫苗设计提供良好靶点。PCV4 尚未国际统一分型，本研究提出的 Cap-27/28 标记可为区域分型与追踪提供新依据。4 结论成功建立高敏感、高特异、重复性好的 PCV2/3/4 三重荧光定量 PCR，适用于大规模临床筛查与混合感染鉴别。明确 PCV2d 与 PCV3a 为国内流行优势型，解析了 Cap 基因关键变异位点，为精准诊断、疫苗更新和分子流行病学研究提供技术支撑和数据基础。关键词：猪圆环病毒 ; 荧光定量PCR ; Cap基因 ; 遗传进化分析 引用本文王鑫雨, 李佳妮, 薄惠文, 马琛琛, 武文娟, 于永乐, 杨海燕, 马清霞, 张传美. 猪圆环病毒2型、3型和4型检测的三重荧光定量PCR建立及Cap基因变异分析[J]. 畜牧兽医学报, 2025, 56(11): 5789-5800 doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2025.11.036WANG Xinyu, LI Jiani, BO Huiwen, MA Chenchen, WU Wenjuan, YU Yongle, YANG Haiyan, MA Qingxia, ZHANG Chuanmei. Establishment of a Triple Fluorescence Quantitative PCR Method for Porcine Circovirus Types 2, 3 and 4 and Analysis of Genetic Evolution of the Cap Gene[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2025, 56(11): 5789-5800 doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2025.11.036  

猪盖塔病毒（Getah Virus, GETV）是披膜病毒科甲病毒属的蚊媒传播 RNA 病毒，近年在我国多省爆发GIII型变异株疫情，对新生仔猪、哺乳仔猪致死率极高（可达80%），是当前养猪业重点防控的 “隐形杀手”。以下从核心维度拆解，帮你快速掌握关键信息与防控要点。一、流行现状：从局部到广泛的传播盖塔病毒最早于1955年在马来西亚的白线斑蚊中被分离出来，我国于1964年在海南的蚊虫中首次分离到该病毒。起初，该病毒仅在我国少数地区存在，但传播范围迅速扩大。2006年前，全国仅有6个省报告发现GETV，到2018年受影响省份增加到16个，而截至目前，我国大部分省份均有GETV的分布。一项在江西省进行的流行病学调查结果更为直观：在接受调查的46个猪场中，44个猪场检测出GETV阳性，阳性率高达95.65%。在411份样本中，病毒阳性率为47.93%，几乎每两份样本中就有一份带毒。这一数据揭示了GETV感染的普遍性和严重性。当前的流行毒株主要是GETV-Ⅲ型变异株。2024年河南、湖北的GETV疫情就是由这种变异株引起，其E2蛋白发生了特定的氨基酸突变，导致病毒毒力增强。二、病毒特性：蚊媒传播与多宿主感染盖塔病毒属于披膜病毒科甲病毒属，是一种单股正链RNA病毒，病毒颗粒呈球形，直径约70纳米，有囊膜结构。GETV主要通过蚊虫叮咬传播，形成“猪-蚊-猪”的传播循环，其传播媒介包括库蚊、伊蚊等。猪群在GETV传播中扮演着“放大器”的角色——感染猪会出现高水平的病毒血症，使病毒更易于被蚊子摄取并传播给其他动物。更复杂的是，盖塔病毒的宿主范围广泛，已知可感染高达19种动物，马和猪是其主要宿主。血清学调查还证实部分人群中存在GETV抗体阳性，虽然人类感染GETV的具体情况还需进一步研究，但这也提醒我们要注意人与动物之间的潜在传播风险。三、临床表现：不同猪群的差异性症状盖塔病毒感染在不同类别的猪群中表现出截然不同的临床症状，这使得诊断变得复杂。妊娠母猪感染后主要表现为繁殖障碍。症状包括流产、死胎等，感染流产率可达15%-25%，多集中于妊娠60-90天。新生仔猪感染后情况最为严峻，表现为出生站立困难、吸吮反射弱、高热或体温过低、腹泻、后肢麻痹、共济失调等神经症状。可引起哺乳仔猪高死亡率，严重时甚至高达80%-100%。相比之下，育肥猪或成年猪感染后多无明显症状或症状较轻，死亡率低，多数为隐性感染。但它们仍然可能成为病毒的携带者和传播者，为猪场的疫情防控带来隐患。四、鉴别诊断：相似疾病的科学区分在临床实践中，盖塔病毒感染需与几种表现相似的疾病进行准确鉴别。这包括猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、日本乙脑（JEV）以及伪狂犬（PRV）。PRRSV感染往往还伴随母猪呼吸道症状，肺部病变更为典型；PPV感染多表现1-3胎出现高比例木乃伊胎，母猪多无发热症状。日本乙脑感染常有更明显高热与脑炎症状；而伪狂犬感染常伴有仔猪神经性高致死与典型脑脊髓炎。通过专门的实验室诊断技术，如RT-qPCR和血清学检测，可以准确鉴别这些疾病，为防控提供方向。五、科学防控：构建全方位防御体系面对GETV的威胁，科学防控至关重要。目前，市场上尚无商业化的GETV疫苗，防控应坚持“预防为主、综合防控”的原则。切断蚊虫传播途径是防控的关键。在环境管理上，要清除猪场内外无用的积水，定期清理杂草，破坏蚊虫滋生地。猪舍门窗、通风口应安装小孔径的防虫网，阻止蚊虫进入。在蚊虫活跃季节，定期对猪舍内外环境喷洒对猪只安全的菊酯类药物，降低蚊虫密度。加强饲养管理和生物安全措施同样不可或缺。对流产胎儿、死胎、胎盘等污染物进行严格消毒和无害化处理，防止病毒扩散。同时，严格控制人员、车辆和物品的进出，避免引入外部病毒。建立健全的猪场监测体系是早期发现疫情的关键。定期对猪群进行健康检查和血清学检测，及时发现感染病例。一旦发现疑似病例，要立即进行隔离和诊断，采取相应的防控措施，防止疫情扩散。随着对盖塔病毒研究的深入，未来在疫苗研发方面有望取得突破。当前，多个研究团队正在进行GETV的基因组特性分析，为疫苗开发提供科学依据。面对这个潜在威胁，养猪从业者既不能恐慌，也不可掉以轻心。唯有通过科学的防控措施，才能有效保障猪群健康，守护养猪业的稳健发展。

冬季来临，气温持续走低，猪场呼吸道疾病进入高发期，猪支原体感染成为首要诱因之一。这种感染不仅会导致猪只日均增重显著下降，还会破坏呼吸道黏膜屏障，为蓝耳、伪狂犬等重大疾病敞开“防疫大门”，即便外观健康的猪只，也可能存在“亚临床感染”，成为养殖利润流失的隐形通道，给猪场带来直接经济损失。　　面对复杂的防控形势，单一防控方案已难以应对，“一场一案”的精准防控理念逐渐成为主流。其核心优势在于摒弃“一刀切”模式，根据猪场感染状态阴性场、暂时阴性场、亚临床感染场、临床感染场等制定差异化策略，既避免防控不足或过度防控，又能针对性解决不同猪场的防控难点，兼顾效果与成本。　　具体防护中，疫苗合理应用是关键。可结合活疫苗起效快、保护周期长与灭活疫苗抗原含量高的特点，针对仔猪、育肥猪、种猪等不同群体制定接种计划。同时，强化生物安全管理，做好环境消杀、人员与车辆流动管控，从源头阻断病原体传播。对于高感染压力猪场，可采用“活疫苗+灭活疫苗”联合方案，搭配药物控制降低感染率；有净化需求的猪场，可借鉴国际先进经验，通过“疫苗驯化+封群管理+生物安全”的综合措施提升净化成功率。　　日常监测同样不可或缺，借助PCR、抗体检测等手段及时掌握猪群健康状况，为防控方案调整提供依据。吉林正业生物等企业的实践表明，“一场一案”通过整合疫苗、药物、监测、生物安全等多重措施，既能有效控制支原体感染，改善猪群健康度和生产性能，又能降低养殖成本，成为冬季猪场切断“隐形利润”流失、筑牢防疫屏障的有效路径。　　王泰伟

江苏农科院李彬团队发表于“Veterinary Microbiology”，题名为“Molecular characteristics of the immune escape of coronavirus PEDV under the pressure of vaccine immunity”的文章。摘要冠状病毒在疫苗和环境因素带来的免疫压力作用下，发生了进化与突变，导致突破性感染时引发的后果更为严重。然而，冠状病毒的进化突变与免疫压力之间的具体关联仍不明确。猪冠状病毒 - 猪流行性腹泻病毒（PEDV） 已存在数十年。本研究通过体内制备抗PEDV的多克隆抗体，并经体外连续传代鉴定出关键中和表位。随后成功构建了重组突变株，体外实验证实rA1273P 株具备逃逸多克隆抗体中和作用的能力。体外细胞研究与体内动物实验均表明，该毒株在规避疫苗接种后的抗体压力时，仍能维持毒力与致病性。该菌株在逃逸免疫压力时的致病性与野生型毒株相当。通过对比疫苗株与临床株的 S 蛋白基因，发现临床株的 1273 位氨基酸存在突变。总的来说，本研究通过连续传代，在免疫压力下鉴定出一个新型PEDV S 蛋白中和位点，表明 1273 位氨基酸在长期抗体压力下易发生突变，从而增强病毒的宿主逃逸能力。本研究为解析冠状病毒逃逸免疫压力的机制提供了新见解，并为监测和预测冠状病毒的变异进化提供了技术支持。研究意义冠状病毒因其高度变异性，构成了持续存在的公共卫生威胁。2010 年以来，高致病性 PEDV 毒株的出现给全球养猪业带来重大经济损失。PEDV 在外界免疫压力下进化变异，使其防控难度日益增加。我们通过一系列体外传代实验，成功制备抗 PEDV 多克隆抗体并鉴定出 S 蛋白上一个新的中和表位（第 1273 位氨基酸）；进一步研究发现，该蛋白的 A1273P 突变虽未改变 PEDV 的致病能力，却能显著提升其在体内外逃避宿主免疫、感染宿主的效率。最后发现，临床 PEDV 毒株 S 基因第 1273 位氨基酸位点存在不同程度突变，该研究为冠状病毒进化变异与免疫压力的特异性关联提供了依据。关键词冠状病毒；猪流行性腹泻病毒（PEDV）；免疫逃逸；免疫压力；S 蛋白（刺突蛋白）冠状病毒可导致人类和动物出现多种呼吸道、胃肠道及中枢神经系统疾病，严重威胁人类健康并造成沉重经济负担。从分类学分类来看，冠状病毒归属于网巢病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属；该属病毒具有包膜，基因组类型为线性单链正义 RNA。该病毒基因组编码四种核心结构蛋白，分别为核衣壳蛋白（N）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和刺突蛋白（S）。其中 S 蛋白通过其受体结合域与 N 端结构域介导病毒包膜与宿主细胞受体的结合，这一过程是病毒与宿主细胞融合的关键。冠状病毒可通过突变和重组（尤其是 S 蛋白结合位点的特异性突变）主动适应新环境，这种适应能力不仅能让病毒有效拓展宿主范围、改变组织嗜性，还会显著影响其致病性、传播效率及宿主感染后的免疫反应。因此，阐明冠状病毒新发变异株的临床特征、解析病毒突变的进化模式，可为预测未来变异株涌现及筛选关键中和抗体结合位点提供全新视角，这对遏制疾病传播、预防后续疫情暴发具有关键意义。猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于 α 冠状病毒属，最早于 20 世纪 70 年代在英国和比利时被发现。2010 年以前，由于 PEDV CV777 株灭活疫苗和减毒疫苗的广泛使用，我国的 PEDV G1a 经典亚群仅造成零星散发和区域性疫情，感染率得到有效控制。然而 2010 年 10 月，我国南方省份突发高致病性 PEDV G2a 变异株，其迅速扩散至全国。即便接种了经典疫苗的猪场，新生仔猪也全部死亡，死亡率达 100%。2013 年，美国也出现了 G2b 型高致病性 PEDV，导致全国猪群 10% 死亡，且快速蔓延至全球多国，给全球养猪业带来巨额损失。G2b 毒株暴发后，美国又出现了一株新变异株，其 S 基因存在大量核苷酸插入缺失，该毒株被命名为 S-INDEL 毒株。我国虽已广泛应用针对 PEDV G1、G2 亚群的商品化疫苗，但近期流行病学数据显示，近年 PEDV 流行率与感染率仍居高不下，给我国养猪业带来了严峻挑战。大量研究证实，S 蛋白突变是导致 PEDV 毒力和感染性改变的主要因素。目前已在 S 蛋白中发现至少五个中和表位区域，分别为 N 端结构域 S10 表位（NTD/S10）、核心中和表位 COE、S1D 结构域 SS2 表位、SS6 表位及 C 端 2C10 表位，此外，C 端的 2C10 表位区域也在其中。对不同亚型代表毒株 S 蛋白氨基酸序列的比较分析显示，同一亚型毒株的遗传变异程度较低，而不同亚型毒株的 S 基因差异显著；S 蛋白的最大差异区域为 N 端 1-400 位氨基酸，该区域包含完整的 S10 中和表位。对疫苗株 CV777、ZJ08 及不同亚型多种参考毒株的 S 蛋白氨基酸序列进行比对分析后发现，SS2 和 2C10 中和表位的保守性最强，SS6 与核心中和表位 COE 的变异性则更为明显。相较于 CV777、ZJ08 等 G1b 疫苗株，SS6 表位存在丝氨酸残基 L763S 和 D765S 替换；COE 表位的氨基酸变异较为复杂，G2c 亚型与 S-INDEL 毒株在该表位的第 516、548、593、632 位共享相同氨基酸替换，G2a 与 G2b 亚型则有不同程度的氨基酸置换。研究已证实，S 基因序列的突变是PEDV毒力变化的主要驱动因素，但 S 基因中发挥关键作用的特定核心氨基酸突变仍不明确。本研究拟在抗体压力下系统筛选可逃逸多种中和抗体的 PEDV 变异株，明确中和抗体靶向的关键氨基酸残基，分析这些残基变异对病毒特性的影响，并通过动物实验验证其在 PEDV 致病及 S 蛋白介导的抗体中和中的功能。研究结果有望为提升疫苗效价与安全性提供新的科学支撑，对抗体类疗法及疫苗应用过程中耐药性风险的监测与评估具有重要理论和实践价值。材料和方法病毒和细胞病毒：PEDV AH2012/12 株（GenBank 登录号：KU646831）本实验室分离和保存。病毒维持液：含 5 μg/mL 胰蛋白酶（Sigma）和 37.5 μg/mL 胰酶（Sigma）的DMEM培养基（Gibco，美国）。细胞：非洲绿猴肾细胞（Vero 细胞，ATCC 编号：CCL-81），生长液为含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基，培养条件为 37°C、5% 二氧化碳。猪流行性腹泻病毒（PEDV）多克隆抗体（pAb）的制备将纯化的PEDV浓缩病毒液经0.1%甲醛溶液于37°C灭活2小时后，加弗氏完全佐剂乳化。选取1头4周龄SPF级仔猪，免疫4次，每次间隔4周。末次免疫5天后，采集血液，37°C处理2小时后 12 000转/分钟离心5分钟取血清，于-20°C以下进行保存｡通过连续传代获得多克隆抗体逃逸株首先，将 PEDV AH2012/12 株与多克隆抗体（pAb，稀释比例1:10）混合，于37°C作用1小时。随后，将该混合物接种至24孔板中的Vero细胞单层，37°C 孵育2小时后，弃去混合物，并用DMEM洗涤3次。随后，加入含多克隆抗体（pAb，稀释比例 1:10）、5 μg/mL 胰蛋白酶及 37.5 μg/mL 胰酶的培养基，继续培养。同时设置对照组：Vero 细胞接种 PEDV AH2012/12 株，且培养体系中不含 pAb。待观察到细胞病变效应（CPE）后，收集病毒并用于下一代的多克隆抗体压力传代。若48小时后未观察到CPE，则将细胞洗涤 2 次，培养基更换为含5 μg/mL 胰蛋白酶及 37.5 μg/mL 胰酶但不含多克隆抗体（pAb）的DMEM，继续培养直至观察到 CPE。每传10代 后，对 AH2012/12 株的 S 基因进行测序。当两组（实验组与对照组）同时观察到 CPE 时，终止该多克隆抗体压力下的病毒连续传代。PEDV重组病毒的构建重组PEDV毒株采用CRISPR/Cas9 技术构建，通过重叠PCR和体外转录技术，分别构建了3对靶向 PEDV S 基因的单向导 RNA（sgRNA）。PCR 扩增以 sgRNA-F/sgRNA-R 引物对和恒定反向引物 Scaffold 寡核苷酸为引物进行。PCR 反应采用 SuperFi-Green PCR 预混液（Invitrogen）进行，反应程序如下：98°C 预变性 3 分钟，随后进行 34 个循环（98°C 变性 30 秒、55°C 退火 30 秒、72°C 延伸 30 秒），最后 72°C 终延伸 5 分钟。之后，使用 DNA 纯化试剂盒（Omega Bio-tek）对 PCR 扩增产物进行纯化，纯化后的产物用作单向导 RNA（sgRNA）转录的模板。单向导 RNA（sgRNA）的转录反应体系为 20 µL，包含 2 µL 10× 转录缓冲液、2 mM 三磷酸核苷（NTPs）、40 单位核糖核酸酶抑制剂（RNase inhibitor，TaKaRa）、1 µL 二硫苏糖醇（DTT）及 100 单位 T7 RNA 聚合酶（NEB），于 37°C 孵育过夜。转录产物经酚 - 氯仿法纯化后，溶于无核糖核酸酶（RNase-free）水中。随后，采用 CRISPR/Cas9 技术对携带 AH2012/12 株基因组的重组细菌人工染色体（BAC）质粒进行体外酶切。酶切后的重组 BAC 质粒经纯化后，使用 In-Fusion 克隆试剂盒（TaKaRa）通过同源重组将同源重组片段连接至 BAC 质粒中。通过聚合酶链式反应（PCR）及桑格测序（Sanger sequencing，中国南京擎科生物科技有限公司）验证阳性克隆中目标序列的正确性。本研究使用的引物序列详见补充表 S1（Table S1）。病毒噬斑试验将PEDV病毒液进行 10 倍系列稀释后，加入铺满Vero细胞单层的 6 孔板作用 1.5 小时（37°C）。随后，用DMEM洗涤细胞 2 次以去除未吸附的病毒，接着向每孔加入 2 mL 含 1.5% 甲基纤维素、5 μg/mL 胰蛋白酶及 37.5 μg/mL 胰酶的 DMEM 培养基作为覆盖液。37°C 孵育 48 小时后，用 4% 多聚甲醛固定细胞，再以 0.1% 结晶紫进行染色。病毒生长动力学分析将相应PEDV以 0.1 MOI接种至 24 孔板中的Vero细胞单层，37°C 孵育 1.5 小时。孵育结束后，用DMEM洗涤细胞 2 次后弃去病毒上清液，随后向每孔加入 500 μL 含 5 μg/mL 胰蛋白酶及 37.5 μg/mL 胰酶的 DMEM 培养基。在多个时间点收集细胞上清液，采用TCID₅₀法测定病毒滴度。免疫荧光试验（IFA）将相应的PEDV以 0.1MOI感染 48 孔板中的Vero细胞单层。感染 24 小时后，去除上清液，用 4% 多聚甲醛于室温固定细胞 15 分钟；随后用预冷甲醇溶液固定 10 分钟，再以 5% 脱脂奶于 37°C 封闭 1 小时。之后PBS洗涤细胞 3 次，加入小鼠抗 PEDV N 蛋白单克隆抗体（稀释比例 1:500）孵育 1 小时；PBS 洗涤 3 次后，加入FITC偶联的山羊抗小鼠 IgG 抗体（稀释比例 1:2000）及 0.1%DAPI，于室温孵育 1 小时。最后用 PBS 洗涤细胞 3 次，在荧光显微镜（尼康，Nikon）下观察荧光分布情况。病毒中和试验为测定多克隆抗体（pAb）对相应PEDV的中和能力，参照 Song 等人先前描述的方法进行多克隆抗体中和试验。简要步骤如下：首先将多克隆抗体于 56℃灭活 30 分钟，随后进行倍比稀释，与等体积的PEDV（200 TCID₅₀/100 µL）混合；混合物于 37℃作用 1 小时后，加入终浓度为 10 µg/mL的胰蛋白酶；随后将该抗体-病毒混合物接种至 96 孔细胞培养板中的Vero 细胞单层；37℃孵育 2.5 小时后，弃去混合物，用DMEM洗涤细胞三次；最后连续观察 3-5 天，记录CPE的发生情况。RNA 提取与实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）采用总 RNA 提取试剂盒从感染相应PEDV的Vero 细胞、肠道拭子或组织样本中提取总 RNA。随后使用 HiScript II Q RT SuperMix 逆转录试剂盒将 RNA 逆转录为cDNA。RT-qPCR 实验在 ABI QuantStudio 6 Flex 实时荧光定量 PCR 系统上进行，所用试剂为 SYBR Green PCR Master Mix。对于 Vero 细胞样本，以GAPDH基因为内参基因，采用 2-ΔΔCt 法对 PEDV 核蛋白（N）基因的 mRNA 表达水平进行归一化处理并计算相对表达量；对于粪便拭子或肠道组织样本，采用绝对荧光定量 PCR 法检测病毒 RNA 含量。所用PEDV-N基因的引物及探针序列如下：上游引物：5′-CTGTTGTTGCCATTGCCACGA-3′；下游引物5′-GTCTGAAAAGCCAATCATTC-3′；探针：5′-TTGCCTCTGTTGTTACTC-3′。多克隆抗体对PEDV吸附的抑制作用为探究多克隆抗体（pAb）对病毒吸附过程的影响，实验步骤如下：将稀释比例为 1:10 的 pAb 与 PEDV 在 37℃下作用 1 小时；随后将 Vero 细胞于 4℃预冷 30 分钟，加入上述抗体-病毒混合物并在 4℃下孵育 1 小时，该条件仅允许病毒结合细胞表面而不发生内化；用冰预冷的PBS洗涤细胞三次，以去除未结合的游离病毒。取部分细胞提取总 RNA，用于评估 pAb 对 PEDV 吸附的抑制效果；剩余细胞经固定、封闭处理后进行IFA检测，通过蔡司（Zeiss）激光共聚焦荧光显微镜观察荧光分布情况，并采用 Image J 软件对绿色荧光强度进行定量分析。免疫印迹分析将6孔板中的 Vero 细胞用PEDV AH2012 株以 0.1 MOI进行感染，同时设置 mock 感染组（模拟感染组，即未感染病毒的对照组）。感染后 24 小时（hpi），用预冷的PBS洗涤细胞，随后加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀测定缓冲液裂解细胞。免疫印迹实验步骤如下：将细胞裂解液于 100℃煮沸 10 分钟进行变性处理；SDS-PAGE对蛋白进行分离；采用电转印法将凝胶中的蛋白转移至聚偏氟乙烯膜上；用含 5% 脱脂奶粉的 PBS 封闭膜后，加入多克隆抗体（pAb）于 37℃孵育 1 小时；用含吐温的 Tris 缓冲盐溶液（TBST）洗涤膜三次，随后加入HRP标记的二抗，室温孵育 1 小时；最后，使用 Western ECL 化学发光底物，通过伯乐（Bio-Rad）ChemiDoc 成像系统进行蛋白信号检测。重组PEDV毒株的致病性评估选取 15 头 5 日龄、PEDV抗原与抗体均为阴性的仔猪，随机分为三组（每组 5 头）：rAH2012/12 组、rA1273P 组及对照组。每组仔猪经口服途径接种指定病毒，接种剂量为 1×104.5TCID₅₀。攻毒后每日观察仔猪临床症状，同时采集肛拭子，通过RT-qPCR检测排毒情况。当仔猪出现死亡或实验结束时，对其实施安乐死，取小肠组织放入 10% 甲醛溶液中固定，用于后续HE 染色及免疫组织化学分析。免疫 AH2012/12 疫苗后对仔猪的攻毒试验选取 25 头 5 日龄、PEDV抗原与抗体均为阴性的仔猪，随机分为 5 组（每组 5 头），分室饲养。免疫组仔猪肌肉注射 PEDV 灭活疫苗，对照组仔猪则肌肉注射PBS。疫苗接种后 14 天（dpv），对免疫组仔猪进行加强免疫。分别于免疫前、免疫后 14 天及 24 天采集仔猪血清，用于后续相关检测。疫苗接种后 24 天（dpv），仔猪口服PEDV进行攻毒，剂量为2.0×10⁶TCID₅₀。攻毒后每日观察仔猪临床症状，同时采集肛拭子，采用RT-qPCR检测排毒情况。当仔猪出现死亡或实验结束时，对其实施安乐死，取小肠组织放入 10% 甲醛溶液中固定，用于后续HE 染色及免疫组织化学分析。PEDV S 蛋白的建模分析采用 AlphaFold3 软件对亲本毒株及 rA1273P 毒株的七肽重复区（HR 区）和 S 蛋白结构进行分析。AlphaFold3 通过其公共网络服（https://www.alphafoldserver.com）运行，建模得到的三级结构采用 PyMOL 软件进行可视化处理及对比分析。统计学分析所有数据均以平均值 ± 标准差（SD）表示，采用 GraphPad Prism 8 软件（GraphPad Software, Inc.）进行统计学分析。两组间比较采用双尾非配对 t 检验，多组间比较采用 Bonferroni 多重比较检验。统计学显著性标注如下：* 表示 P 结果PEDV S 蛋白在抗体压力下发生多点突变为模拟PEDV在治疗性抗体压力下的进化过程，本研究制备了高免血清（多克隆抗体，pAb）。间接免疫荧光试验（IFA）结果显示，该 pAb 可与过表达的 S 蛋白及 PEDV 感染的细胞发生特异性结合（图 1A）；免疫印迹试验（Western blotting）同样证实，该 pAb 能与过表达的 S 蛋白特异性结合（图 1B）。为测定多克隆抗体（pAb）对PEDV的中和能力，本研究开展了病毒中和试验。间接免疫荧光试验（IFA）结果显示，该 pAb 能有效中和病毒感染，减少受感染细胞数量（图 1C）。此外，IFA 与RT-qPCR结果共同表明，该 pAb 可显著抑制 PEDV 的吸附过程（图 1D~F）。为筛选多克隆抗体（pAb）的关键作用位点，本研究在抗体压力下对PEDV进行连续传代，获得 pAb 逃逸突变株。病毒中和试验结果显示，pAb 对抗体压力下传代至第 20 代、30 代和 40 代的病毒，其中和抗体效价呈逐步下降趋势，而对第 10 代病毒的中和效价无变化（图 1G）。生长动力学与噬斑试验结果显示，抗体压力筛选获得的病毒与野生型毒株无显著差异（图 1H、I）。对不同代次的原始病毒及抗体压力下的病毒 S 基因进行测序分析，结果显示：第 10 代病毒的第 976 位氨基酸发生酪氨酸（Y）→组氨酸（H）突变；第 20 代病毒的第 1005 位氨基酸发生丝氨酸（S）→丙氨酸（A）突变；第 30 代病毒的第 1273 位氨基酸发生丙氨酸（A）→脯氨酸（P）突变（图 1J）。这些中和压力下关键氨基酸位点的突变，提示冠状病毒可能存在逃避宿主免疫应答的潜在机制。图 1 抗体压力下猪流行性腹泻病毒（PEDV）S 蛋白发生多点突变。（A）通过间接免疫荧光试验（IFA）鉴定 PEDV 多克隆抗体（pAb）。（B）通过蛋白质印迹法（Western blotting）鉴定 PEDV 多克隆抗体（pAb）。（C）通过间接免疫荧光试验（IFA）检测多克隆抗体（pAb）对病毒的中和作用。（D）间接免疫荧光试验（IFA）结果显示多克隆抗体（pAb）可抑制病毒吸附。（E）使用 Image J 软件对绿色荧光强度进行定量分析。（F）实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）结果表明多克隆抗体（pAb）可抑制病毒吸附。（G）多克隆抗体（pAb）对不同病毒的中和作用。（H）病毒连续传代的生长曲线。（I）病毒连续传代的空斑试验结果。（J）压力条件下不同传代后 PEDV S 基因的测序结果。重组PEDV毒株的构建及特性分析为验证上述三个氨基酸位点的功能意义，本研究利用反向遗传系统成功构建了三株重组毒株，分别命名为 rY976H、rS1005A 和 rA1273P，测序结果证实各突变位点均正确插入（图 2A）。为评估上述突变毒株的特性，本研究开展了致病性观察与生长曲线测定实验。间接免疫荧光试验（IFA）结果显示，各重组毒株均能感染细胞，并诱导产生与野生型毒株相似的细胞病变效应（图 2B）。病毒生长动力学分析表明，重组毒株与野生型毒株的生长趋势相当（图 2C）。此外，噬斑试验结果显示，三株重组病毒与野生型毒株的噬斑形态无显著差异（图 2D）。为进一步证实可逃避抗体压力的关键突变位点，本研究检测了各毒株的中和抗体效价。采用多克隆抗体（pAb）进行的病毒中和试验结果显示，针对第 40 代传代病毒及重组病毒 rA1273P 的中和抗体效价显著下降（图 2E）。此外，间接免疫荧光试验（IFA）与实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）结果表明，与其他毒株相比，重组病毒 rA1273P 表现出显著的血清抗体中和逃逸能力（图 2F~H）。这些发现证实了PEDV S 基因第 1273 位氨基酸丙氨酸（A）→脯氨酸（P）突变的关键意义。图 2 重组猪流行性腹泻病毒（PEDV）株的构建及特性分析（A）三株重组病毒构建成功。（B）通过间接免疫荧光试验（IFA）鉴定重组病毒。（C）重组病毒的生长曲线。（D）重组病毒的空斑试验结果。（E）多克隆抗体（pAb）对各重组病毒的中和能力。（F）多克隆抗体（pAb）抑制多株重组病毒入侵的间接免疫荧光试验（IFA）结果。（G）使用 Image J 软件对绿色荧光强度进行定量分析。（H）多克隆抗体（pAb）抑制多株重组病毒入侵的实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）结果。重组病毒的毒力评估为深入评估重组病毒的毒力，本研究对 5 日龄仔猪开展了攻毒试验。粪便评分结果显示，重组病毒 rA1273P 引起的腹泻严重程度与野生型病毒相当（图 3A）。病毒粪便排泄检测结果表明，重组病毒与野生型病毒的排毒量相当，排泄峰值出现在感染后第 3 天（图 3B）。临床记录显示，重组病毒与野生型病毒均会导致仔猪出现严重腹泻，且伴随肠胀气、肠壁变薄及肠壁透明化等症状（图 3C）。此外，组织学分析结果显示，攻毒组仔猪肠道出现绒毛萎缩与断裂现象，且绒毛高度与隐窝深度比值显著降低（差异具有统计学意义）；重组病毒与野生型病毒引发的上述病理变化无显著差异（图 3D）。肠道绒毛免疫荧光染色结果进一步证实，重组病毒与野生型病毒均能感染肠道绒毛（图 3C）。此外，两组攻毒组仔猪空肠与回肠组织中的病毒载量无显著差异（图 3E）。生存曲线结果显示，重组病毒攻毒组与野生型病毒攻毒组的所有仔猪均在感染后第 7 天死亡（图 3F）。这些发现证实，突变毒株 rA1273P 与野生型毒株的致病性相当。图 3 重组病毒的毒力评估（A）野生型病毒与突变病毒致仔猪腹泻情况统计。腹泻评分标准：0 分 = 固体粪便；1 分 = 糊状粪便；2 分 = 半液体粪便；3 分 = 液体粪便。（B）口服 PEDV 后，肛拭子中病毒排泄量的每日定量分析。（C）仔猪腹泻状态、解剖图、HE 染色结果及 IFA 检测结果。（D）仔猪肠道绒毛与隐窝比值的统计分析。（E）仔猪回肠和空肠段的病毒载量。（F）仔猪存活率。重组病毒的体外抗中和抗体逃逸实验在证实重组病毒与野生型病毒致病性相当后，研究人员进一步开展体外实验，以验证该重组病毒的抗体逃逸能力。为证实该重组病毒对猪体可能存在的免疫逃逸作用，研究人员按图 4A 所示方案，采用 AH2012/12 型PEDV灭活毒株或PBS，对 5 日龄仔猪开展两轮免疫接种。此外，另设 5 头未接种疫苗且未攻毒的仔猪作为对照组。仔猪于免疫接种 24 天后进行攻毒。攻毒前ELISA结果显示，免疫组仔猪血清中的IgG 抗体水平显著高于PBS对照组（图 4B）。通过中和抗体水平检测、间接免疫荧光实验及RT-qPCR开展体外验证，结果证实免疫血清对 rA1273P 突变毒株无保护效力；与之相反，该免疫后血清对 rAH2012 野生型毒株则表现出强效的免疫保护作用（图 4C - F）。图 4 重组病毒在体外逃逸中和抗体的作用（A）动物实验免疫与攻毒流程示意图。（B）免疫后攻毒前猪体内 IgG 抗体水平检测。（C）免疫后血清对重组病毒及亲本病毒的中和能力。（D）通过 IFA 检测免疫后血清对重组病毒及亲本病毒的吸附抑制能力。（E）使用 Image J 软件对绿色荧光强度进行定量分析。（F）通过 RT-qPCR 分析免疫后血清对重组病毒及亲本病毒的吸附抑制能力。重组病毒的体内抗中和抗体逃逸实验为进一步评估该重组病毒逃逸中和抗体的潜在能力，研究人员对攻毒后仔猪的临床症状展开持续监测。腹泻评分结果显示，PBS对照组仔猪的腹泻症状比免疫组更为严重；而在免疫组内部，重组病毒 rA1273P 毒株所致仔猪腹泻的严重程度高于亲本毒株（图 5A）。全程实验中，未接种疫苗且未攻毒的对照组仔猪未出现任何腹泻症状。肛拭子排毒量检测结果表明，PBS对照组的排毒量高于免疫组；免疫组内 rA1273P 毒株的排毒量虽略高于亲本毒株，但仍低于PBS对照组（图 5B）。生存曲线分析显示，免疫后感染 rA1273P 毒株的实验组仅出现 1 例仔猪死亡，与相关组别相比无统计学差异（图 5C）。大体病理学检查、组织切片观察及免疫荧光检测等多项临床表征结果显示，PBS对照组仔猪出现严重腹泻症状，且肠道组织中可见明显的绒毛萎缩、断裂现象，同时检测到病毒感染的阳性信号（图 5D）。在免疫组中，相较于亲本毒株，rA1273P 毒株引发的腹泻症状更严重，造成的肠道绒毛损伤更显著，且病毒载量也更高；而未攻毒的对照组仔猪未出现明显病理变化。此外，免疫组中感染重组病毒的仔猪，其空肠与回肠组织内的病毒载量显著高于感染亲本毒株的仔猪（图 5E）。对组织病理切片的统计学分析同样显示，感染重组病毒的仔猪肠道绒毛与隐窝的比值下降，且绒毛损伤程度进一步加重（图 5F）。此外，研究人员对美国国家生物技术信息中心数据库中逾千株猪流行性腹泻病毒的 S 蛋白进行分析，重点比对其第 1273 位氨基酸位点。结果显示，所有商品化疫苗毒株的该位点均为丙氨酸，而有 7 株临床分离毒株在该位点出现了氨基酸变异（图 5G）。上述研究结果表明，疫苗与治疗性抗体的应用或许会加速PEDV通过变异实现免疫逃逸，不过该病毒发生变异的具体机制仍有待进一步探究。图 5 重组病毒在体内逃逸中和抗体的作用（A）不同组动物的腹泻评分。腹泻评分标准：0 分 = 固体粪便；1 分 = 糊状粪便；2 分 = 半液体粪便；3 分 = 液体粪便。（B）口服 PEDV 后，肛拭子中病毒排泄量的每日定量分析。（C）不同组动物的存活率。（D）仔猪腹泻状态、解剖图、HE 染色结果及 IFA 检测结果。（E）仔猪回肠和空肠段的病毒载量。（F）仔猪肠道绒毛与隐窝比值的统计分析。（G）疫苗株与临床分离毒株第 1273 位氨基酸的序列比对结果。PEDV S 蛋白 A1273P 突变不改变蛋白整体结构PEDV的 S 糖蛋白由 S1 和 S2 两个亚基组成。N 端的 S1 亚基负责介导受体结合，是中和抗体的主要作用靶点。与之不同，S2 亚基参与病毒与细胞的融合过程，包含多个关键结构域：蛋白酶切割位点 S2′、融合肽（FP）、七肽重复区 1（HR1）、七肽重复区 2（HR2）、跨膜结构域（TM）及病毒内尾区（IV）。尽管目前对PEDV S 蛋白的结构已有大量研究，但对其七肽重复区（HR 区）的特征解析仍不够充分。为探究A1273P 突变对融合前 HR1HR2 束整体结构及 S 蛋白三聚体结构的影响，本研究采AlphaFold3 软件进行进一步分析。结果显示，A1273P 突变位于 HR2 区的侧链上，且与六螺旋束区域距离较远（图 6B、C）。该侧链位点的 A1273P 突变未破坏 HR1HR2 蛋白束的整体结构及 S 蛋白的三聚体结构，这与此前针对SARS-CoV-2的相关研究结果一致（图 6B~D）。基于上述发现，本研究提出如下机制假说：多克隆抗体（pAb）特异性靶向 HR 区，进而抑制 HR 区介导的病毒膜融合过程。关键在于，S 蛋白的 A1273P 突变可能会因脯氨酸的环状侧链引发蛋白构象改变，从而丧失与抗体的结合能力，最终使病毒得以逃逸 pAb 的中和作用。图 6 S 蛋白 A1273P 突变不改变整体结构（A）猪流行性腹泻病毒（PEDV，登录号 AMZ01557）、人冠状病毒 229E（HCoV-229E，登录号 AAK32191）、人冠状病毒 NL63（HCoV-NL63，登录号 AAS58177）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV，登录号 AHC74098）、严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV，登录号 AAP13441）及严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS-CoV-2，登录号 YP_009724390）HR2 区域的序列比对。（B）亲本株和（C）rA1273P 突变株的 HR 区域（HR1：粉色；HR2：绿色；第 1273 位氨基酸：红色）局部及整体结构特征，由 AlphaFold3 预测。（D）S 蛋白的卡通结构图和（E）表面结构图，标注于 PEDV S 蛋白的序列视图中（由 AlphaFold3 预测；S1-NTD：蓝色；S1-CTD：黄色；S2：粉色；HR2：绿色；A1273 位氨基酸：红色）。讨论本研究结果表明，在多克隆抗体（pAb）免疫压力下，PEDV S 蛋白会发生一系列点突变。具体而言，S 蛋白第 1273 位氨基酸的丙氨酸（A）→脯氨酸（P）突变，可使病毒逃逸 pAb 的中和作用。此外，动物实验证实，重组毒株 S 蛋白的 A1273P 突变不会影响病毒毒力，但能在体外和体内条件下帮助病毒逃逸抗体压力，最终导致仔猪成功感染并发病。PEDV S 蛋白在结构上分为 S1 和 S2 结构域，其中 S1 结构域包含四个核心亚结构域，分别为 S1₀、S1A、S1B 和 S1CD。S1B 亚结构域含有主要受体结合域（RBD），该区域位于第 510-640 位氨基酸，可与氨基肽酶 N（APN）结合。S1A 和 S1CD 亚结构域中存在中和表位，已鉴定出 5 个特异性区域，分别位于第499-638、636-789、748-755、746-771 和 1368-1374 位氨基酸。已有研究表明，病毒的体外连续传代可有效降低其毒力。但本研究中，病毒在多克隆抗体（pAb）压力下连续传代 40 代后，口服接种仔猪并未出现致病性下降的现象。这主要是因为本研究使用的是单一突变位点的拯救病毒，而非 PEDV 野毒的直接连续传代；此外，体外传代次数相对有限，且仅对 S 基因进行了测序分析，未对全基因组其他基因展开测序验证。此前有研究在传代毒株中鉴定出与毒力减弱相关的突变位点，例如 S1A 亚结构域的 D265A 突变、受体结合域的 F635R 突变，以及 COE 表位区域的 T502I、T555S 和 G600S 突变。另有研究对 S 基因的测序分析显示，与临床毒株及 CV777 疫苗株相比，该基因存在约 50 个氨基酸突变位点。正如以往观察到的，S 蛋白的突变主要集中在 N 端结构域：其中 COE 表位区域存在 8-12 个可变突变位点，SS6 表位区域仅含 1 个氨基酸突变位点，SS2 表位区域则无突变。研究证实，这些区域的氨基酸替换会降低 PEDV 的结合亲和力、抗原性、致病性及中和活性。而本研究中，病毒经 40 代传代后产生的突变主要位于 S2 区域，这与以往报道的 “毒力减弱相关突变多集中在 S1 区域” 形成差异。这些发现提示，PEDV 的 S1 区域可能在病毒毒力调控中发挥更关键的作用，而 S2 区域的功能仍有待进一步探究。通常认为，S1 结构域介导病毒的入侵与吸附过程，并能诱导机体产生中和抗体，而 S2 结构域则负责介导病毒与细胞的膜融合。但 Okda 等人通过全病毒免疫小鼠，成功制备出 8 株高活性中和单克隆抗体，其中 7 株可与 S2 亚基发生特异性结合。此外，Feng 等人鉴定出一株特异性中和单克隆抗体，该抗体能有效中和包括 1 型（CV777 株）和 2 型（LNCT2 株）在内的多种 PEDV 毒株，其识别的中和表位核心序列位于第 1261-1337 位氨基酸之间。这些研究结果共同提供了强有力的证据，表明 S2 亚基同样具备诱导中和单克隆抗体产生的能力，这对传统认为 “中和作用以 S1 结构域为核心” 的认知提出了挑战。本研究在多克隆抗体（pAb）压力下，于 S2 蛋白 C 端附近鉴定出一个新的 A1273P 突变，该突变位点是中和抗体的新关键结合位点。第 1273 位氨基酸位于 S 蛋白的 HR2 区域，AlphaFold3 预测结果显示，A1273P 突变位于 HR2 区的侧链上，且与六螺旋束区域距离较远。结合此前针对SARS-CoV-2的研究，该侧链位点的氨基酸替换未破坏 HR1HR2 的结构完整性及 S 蛋白三聚体的形成。已有研究证实，HR 区是病毒糖蛋白中高度保守的结构，负责介导病毒膜融合。多项研究表明，外源性可溶性 HR2 肽可结合病毒 HR1 区，进而阻断病毒入侵与复制，这一机制在SARS-CoV、MERS-CoV及小鼠肝炎病毒（MHV）中均得到验证。Zhao 等人的研究显示，HR 肽能抑制 PEDV 感染，其中 HR2 肽的抑制效果最为显著；用 HR2 肽免疫小鼠可诱导产生中和抗体，血清经 1:64 稀释后仍能抑制 50% 的 PEDV 感染，这与本研究结果一致。本研究中，S 蛋白的 A1273P 突变使病毒得以逃逸 pAb 的中和作用，其原因可能是脯氨酸的环状侧链导致表位空间结构发生构象改变。与单克隆抗体压力相比，本实验采用的多克隆抗体压力引入了更复杂的影响因素。尽管体外和动物实验均证实该位点突变可介导显著的免疫逃逸，但后续研究应采用不同的单克隆抗体，筛选病毒易发生突变以实现逃逸的关键位点。目前虽已鉴定出 PEDV 的部分中和表位，但对于 S 蛋白中负责逃逸中和抗体的关键氨基酸突变仍不明确。进一步探究 PEDV S 蛋白上的中和表位序列至关重要，这可为研发中和性治疗抗体及高效保护性疫苗奠定理论基础，进而为PED疫苗的开发提供技术支撑。此外，持续监测并预测PEDV的进化方向，对于快速防控其传播至关重要。PEDV 毒株的进化分析显示，疫苗投入使用后，该病毒的进化速率提升了三倍。对来自不同国家的 672 株代表性 PEDV 毒株的分析表明，PEDV G2 亚群毒株的进化模式存在地域偏好性，韩国毒株进化速度最快，中国毒株则表现出最高的重组率。这些发现提示，PEDV 的广泛接种或免疫压力已加速了病毒的进化。因此，通过体外免疫压力下的病毒进化研究，可预测病毒的进化方向，从而及时制定防控措施，减轻变异病毒引发的感染及经济损失。这不仅为病毒进化预测提供了技术支撑，也为筛选关键中和位点、设计新型疫苗提供了重要思路。本研究通过人工诱变技术，在抗体压力下对冠状病毒属成员猪流行性腹泻病毒（PEDV）进行突变诱导，成功获得能逃逸亲本毒株诱导产生的中和抗体的突变株，并发现了此前未被报道的新型中和表位。该研究结果为深入理解冠状病毒的免疫逃逸机制提供了新的视角，也为防控冠状病毒感染的干预策略研发带来了新的启发。注：以上数据仅供参考，不作任何投资建议

一、现象篇：仔猪销量飙升，谁在主导这场 “卖仔” 狂潮？（一）量价齐升：从数据看仔猪销售热潮2025年1-11月，正邦科技、温氏股份等8家上市猪企累计仔猪销量达1193.41万头，同比显著增长，成为生猪市场焦点。11月单月，8家企业仔猪销量合计180万头，环比增幅25.3%，创年内新高。企业分化明显：正邦科技仔猪销量占当月生猪销量53.84%，金新农占比达58.93%，仔猪销售成为核心收入来源。温氏股份11月仔猪销量89.46万头，环比增幅101.26%；神农集团则呈现显著转折，7-9月仔猪销量近乎为零，10-11月合计销量达9.91万头，战略调整信号强烈。价格端同步回暖，12月18日两广地区7kg仔猪主流价270元/头，山河四省260元/头，较9月“百元贱卖”阶段显著回升，进一步助推仔猪销售热潮。（二）生猪市场冰火两重天：卖仔猪成 “止损首选”与仔猪市场火热形成反差，当前全国生猪均价低于6元/斤，远低于7.5-8元/斤的行业平均成本线，自繁自养企业头均亏损超300元。仔猪养殖2-3个月即可出栏，资金回笼快，且头部企业仔猪成本可控制在200-250元/头，按当前价格销售单头盈利50-70元，成为企业“止损止血”的关键选择。二、原因篇：三大逻辑揭秘猪企 “卖仔” 动机（一）短期盈利驱动：价格回暖下的现金流保卫战1. 成本倒挂下的无奈选择：生猪市场长期亏损倒逼企业转向仔猪销售，温氏股份、正邦科技2025年仔猪销量同比分别增长279.17%、132.23%；金新农11月仔猪销售收入占比超60%，有效对冲肥猪业务亏损，缓解资金压力。2. 政策与市场双重催化：11月多地仔猪价格止跌反弹，叠加寒潮导致仔猪成活率下降、养殖成本上升，企业倾向于“落袋为安”，加速仔猪出栏变现。（二）长期风险规避：提前透支产能，转移 2026 年出栏压力1. 生猪价格周期预判：业内普遍看跌2026年春节后猪价，Mysteel预测1月均价或跌至10.6元/公斤，当前出售仔猪可规避未来育肥亏损，通过“时间差”转移市场风险。2. 产能去化的被动选择：截至2025年9月，能繁母猪存栏仍超正常保有量3.5%，产能过剩压制猪价，企业缩减育肥规模，转向轻资产仔猪销售模式降本避险。（三）行业格局重塑：从 “自繁自养” 到 “南繁北育” 的模式切换1. 中小养殖户补栏刚需：北方“公司+农户”模式普及，60%以上中小散户放弃自繁转向外购仔猪，2025年仔猪市场需求同比增长40%，为猪企“以仔代猪”策略提供市场基础。2. 头部企业效率优势：牧原、温氏等通过基因改良将PSY提升至32-35头，仔猪生产成本较散户低30%，规模与成本优势显著，巩固市场地位。三、影响篇：狂卖仔猪，是饮鸩止渴还是破局之道？（一）短期效应：缓解亏损 vs 透支未来企业生存优先：生猪市场连续5个季度亏损，2025年三季度超70%上市猪企资产负债率突破60%，卖仔猪成为“保命”手段。以正邦科技为例，2025年1-11月仔猪收入占比达45%，同比提升25个百分点，有效维持企业基本运营。市场信号混乱：仔猪销量激增可能误导中小散户盲目补栏，加剧2026年生猪供应过剩风险，形成“卖仔-补栏-价格下跌”的恶性循环。若散户盲目补栏，2026年生猪供过于求局面将加剧，进一步压低猪价，延长市场调整周期。（二）行业深层变革：产能去化加速，周期底部临近1. 母猪淘汰提速：10月末能繁母猪存栏降至3990万头，重回4000万头以下，政策引导与市场自发去化双重作用下，低效产能加速出清。政策调控与市场低迷共同推动产能去化，这是市场自我调节、回归健康发展的必经过程。养殖模式分化：大型企业转向“仔猪+种猪”高端市场，中小散户聚焦育肥环节，产业分工细化提升行业专业化程度与资源配置效率。而中小散户则聚焦育肥环节，利用自身灵活的特点，专注于生猪育肥。这种产业分工的细化，使得整个行业的专业化程度更高，资源配置更加合理。不同规模的企业和养殖户在各自擅长的领域发挥优势，提高了整个行业的生产效率。当前猪周期底部特征显现，预计2026年下半年市场有望迎来供需平衡与猪价反转。四、展望：2026 年，猪企如何穿越周期？（一）成本管控成核心竞争力成本管控已成猪企核心竞争力，牧原股份通过智能饲喂系统等技术，将完全成本降至12元/公斤以下，成本差距将决定企业市场竞争力。未来，饲料采购、养殖技术、疫病防控等环节的成本优化能力，将成为企业生存关键，成本控制不力者面临淘汰风险。（二）多元化布局破局为摆脱猪价依赖，温氏股份拓展食品加工与冷链物流业务，拓宽利润来源；新希望涉足乳业、宠物食品等领域，增强抗风险能力。新希望集团同样积极拓展多元化业务，除了在传统的养殖和饲料业务上持续创新外，还涉足乳业、宠物食品等领域。在乳业方面，新希望通过整合优质奶源，推出一系列高品质的乳制品，满足了消费者对健康、营养食品的需求。在宠物食品领域，新希望凭借其在食品研发和生产方面的经验，开发出多种适合不同宠物口味和营养需求的食品，逐渐在宠物市场中崭露头角。部分企业试水“生猪期货+期权”套保，锁定价格对冲波动风险，保障运营稳定。（三）政策与市场协同去产能政策与市场协同推进产能去化，农业农村部要求25家头部企业2026年1月底前合计调减100万头能繁母猪，散户在市场压力下被动退出。双重作用加速产能去化，预计2026年Q3行业将迎来供需平衡点，猪价回归合理区间。猪企“卖仔”是当下亏损的无奈之举，也是对周期的主动预判。行业转机取决于产能去化彻底性与成本管控持续性，2026年市场洗牌后，扛住现金流压力、布局效率升级的企业将笑到最后。

自2018年非洲猪瘟（ASF）传入我国以来，养殖场生物安全管理已成为行业重中之重。然而，ASF病毒的田间变异和环境复杂性，导致防控难度陡增。病毒传播途径不断演变，临床表现日益隐匿，迫使防控策略持续升级。一、场外传播阻断：筑牢外部防线病毒传入多源于空气、环境及物资载体，需针对性防控：1、空气过滤系统优化ASF病毒可通过气溶胶传播，正压过滤系统需强化密封性。重点检查墙体缝隙、风机百叶等漏风点（热成像仪/烟饼检测），发泡胶封堵后需定期复查。过滤棉维护因地制宜：外层粗效棉每月换，初效棉2-3月换，亚高效棉半年换，避免雨雪沙尘削弱效果。2、周边风险主动监测每月1-4次采样高风险点（主干道、农田、临近猪场），使用固定点位空气采样器实现24小时病毒富集，早于传统进风口检测。病毒检出率升高时，立即升级环场道路消毒，暂停露天转群等业务。3、大宗物资科学储备低温季节难消毒物资（如冷冻肉、绿叶菜）提前在9-10月储备：常规物资（输精管、干燥粉）25℃静置1个月；食材自产或储备萝卜、白菜等耐储蔬菜。二、场内传播阻断：严防交叉污染1、栋舍间分区管理严禁人员、物资、猪只串栋。每栋设隔断凳、洗手盆，员工分组定岗。转群前采样检测（1%-3%比例），尾根血拭子浸染量需达50%以上保障检出率。2、定期灭鼠消除机械载体老鼠机械带毒可瓦解分区效果，每年4月、9月集中灭鼠，聘请专业团队按生物安全流程执行。三、监测预警体系：早发现早处置1、双轨监测策略猪只监测：聚焦厌食、沉郁等异常个体，采样率1%-3%；公猪因频繁接触母猪需定期检测。环境监测：每周1次，重点采集风机百叶、工具表面等病毒富集区；弱毒株需同步抗体检测（周/月频次）。2、异常猪闭环管理持续异常猪重点跟踪，恢复后仍需抗体筛查；无饲养价值猪及时淘汰，降低潜伏风险。四、人员执行保障：构建防控闭环1、流程制定与验证兽医团队需实地参与全场景操作，持续优化流程，避免“纸上谈兵”。2、执行监督生产管理员每日巡查，违规操作即时纠正；设立防非专项津贴提升执行力。结语：动态升级，科学防控面对ASF病毒变异与复杂环境，生物安全是唯一有效武器。通过“外阻传入-内防扩散-监测预警-人员落地”四维联动，结合季节性与区域性风险动态调整策略，方能实现降本增效。

引用本文引用王田田, 于瑞明, 张莉萍, 白英杰, 张中旺, 潘丽, 张全伟, 刘新生. 猪德尔塔冠状病毒N蛋白单克隆抗体制备及双抗体夹心ELISA方法建立[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(11): 5326-5337.WANG Tiantian, YU Ruiming, ZHANG Liping, BAI Yingjie, ZHANG Zhongwang, PAN Li, ZHANG Quanwei, LIU Xinsheng. Preparation of Monoclonal Antibody Against N Protein of Porcine Deltacoronavirus and Establishment of Double Antibody Sandwich ELISA Method[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2025, 52(11): 5326-5337.doi:10.16431/j.cnki.1671-7236.2025.11.028甘肃农大/中国农科院兰州兽医研究所张全伟，刘新生等：猪德尔塔冠状病毒N蛋白单克隆抗体制备及双抗体夹心ELISA方法建立作者及单位王田田1, 于瑞明1, 张莉萍2, 白英杰2, 张中旺2, 潘丽2, 张全伟1, 刘新生2  1. 甘肃农业大学生命科学技术学院, 兰州 730070;2. 中国农业科学院兰州兽医研究所, 动物疫病防控全国重点实验室, 兰州 730046长按识别原文二维码基金项目甘肃省科技重大专项(23ZDNA007)文章摘要【目的】制备猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)N蛋白的单克隆抗体并建立一种检测PDCoV抗原的双抗体夹心ELISA方法，为猪群PDCoV感染情况的临床快速、准确检测提供技术支持。【方法】通过原核表达系统表达PDCoV N蛋白并验证，用其免疫BALB/c雌鼠，利用杂交瘤细胞融合技术筛选制备抗PDCoV N蛋白的特异性单克隆抗体，并通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)验证单克隆抗体的反应性和特异性。将筛选到的单克隆抗体进行辣根过氧化物酶(HRP)标记，并分别与未标记的单克隆抗体两两组合配对，选择最优抗体用于双抗体夹心ELISA检测方法的建立，通过棋盘法优化捕获抗体包被浓度和酶标抗体稀释度等条件，条件优化后通过梯度稀释法确定该方法的PDCoV N蛋白和PDCoV的检出限，并验证其重复性和特异性，最终检测临床样品验证该方法与反转录实时荧光定量PCR的一致性。【结果】成功表达出纯度较高的PDCoV N蛋白，用其免疫小鼠4次后其血清抗体效价达到1∶256 000，通过杂交瘤融合技术成功筛选到6株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株(5D2-1、5D2-2、6G7-1、6G7-2、3C5和6F10)。Western blotting、IFA结果显示，筛选到的6株单克隆抗体可与PDCoV N蛋白特异性反应。配对试验结果表明，最佳捕获抗体为5D2-1，最佳检测抗体为6G7-1-HRP。本研究建立的双抗体夹心ELISA方法对PDCoV N蛋白的检出限为2 ng/mL，全病毒的检出限为7.89×103 TCID50/mL，具有良好的灵敏性。批间和批内重复试验变异系数均＜10%，且未见与其他常见猪肠道病毒发生反应，具有良好的重复性和特异性。临床样本检测结果显示，建立的双抗体夹心ELISA方法与反转录实时荧光定量PCR方法符合率为88.19%，Kappa值为0.761，表明该方法可用于PDCoV临床样品的检测。【结论】本研究成功筛选制备了6株针对PDCoV N蛋白的特异性单克隆抗体，建立了一种特异性好、灵敏度高的PDCoV双抗体夹心ELISA检测方法，为PDCoV临床诊断提供了新方法。

近日，南京农业大学动物医学院杨倩教授团队在国际著名期刊《Proceedings of the National Academy of Sciences》发表了题为“Goblet cells dictate viral tropism and pathogenesis in nasal and intestinal mucosae”的研究论文。该研究以猪流感病毒（SIV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）为模型，系统阐明了杯状细胞在病毒黏膜感染过程中的核心调控作用，揭示了不同黏膜组织中病毒嗜性和致病结果截然不同的关键宿主机制。作为黏膜上皮的重要组成部分，杯状细胞传统上被视为“黏液提供者”。它们在病毒建立有效感染、扩散、以及引发黏膜损伤等方面发挥决定性作用。研究发现，尽管SIV与PEDV均可接触并感染鼻腔上皮，但其感染命运显著不同：PEDV在鼻腔仅维持短暂、局灶的感染，并迅速被黏液屏障清除；SIV则能突破基底膜进入固有层，实现更深层的组织扩散。 图1.杯状细胞黏液分泌功能影响PEDV和SIV在肠道黏膜的嗜性单细胞测序结果显示，两种病毒在鼻腔上皮中的受体表达水平并无显著差异，这意味着传统受体理论无法解释其不同的组织嗜性。相反，真正决定两者感染模式的，是杯状细胞对黏液分泌状态的精准调控——PEDV增强黏液分泌从而抑制自身扩散，而SIV抑制黏液分泌，使其在黏膜中更易传播。在肠道黏膜中，研究揭示了PEDV更为独特的致病机制。PEDV可通过激活黏膜下神经元的乙酰胆碱-CHRM3信号通路，诱导杯状细胞形成GAP（Goblet Cell–Associated Antigen Passage）通道。这一用于递送食物抗原、维持免疫耐受的生理通道在PEDV感染后出现“用途转移”——即便肠道上皮结构仍完整，肠道细菌也可通过GAP进入固有层，引发炎症反应，从而加剧肠道损伤并促进病毒扩增。值得注意的是，阻断CHRM3信号可显著抑制GAP形成，感染仔猪的腹泻、体重下降和组织病变均明显减轻，证明GAP在PEDV高致病性中的关键作用。图2.乙酰胆碱和CHRM3之间的相互作用驱动PEDV诱导的PGAP形成该研究从鼻腔到肠道、从单细胞图谱到体内功能验证，构建了一个新的科学框架：病毒嗜性不仅由病毒本身及其受体决定，更由黏膜微环境，尤其是杯状细胞的功能状态所决定。因此，围绕杯状细胞的功能调控，包括增强黏液屏障、抑制GAP形成等，有望成为未来跨病毒种类、跨黏膜系统的广谱抗病毒策略，为呼吸道和肠道重要病毒的防控开辟新方向。图3.杯状细胞介导的SIV和PEDV黏膜嗜性及发病机制示意图该论文第一作者为南京农业大学动物医学院博士研究生王文骞（现入职华中农业大学动物科技学院），通讯作者为南京农业大学李昱辰副教授。研究过程中，杨倩教授为课题提供了重要指导，课题组的林建教授和崔晓靓老师给予了宝贵建议。本研究得到了国家重点研发计划青年科学家项目、国家自然科学基金面上项目、江苏省优秀青年基金和中央高校基本业务费等项目的资助支持。原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.251415012来源：南京农业大学

论文导读猪流行性腹泻（PED）是一种由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的严重肠道传染病，对全球养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV 属于冠状病毒科，具有高度传染性和致病性，尤其对哺乳仔猪的致死率极高。尽管目前已有灭活疫苗和减毒疫苗投入使用，但这些传统疫苗在诱导抗体产生、细胞免疫和黏膜免疫方面存在诸多不足，无法有效抵御病毒入侵。2025年11月06日，四川农业大学研究团队在vaccines上发表题为“Recombinant AAV vaccine expressing PEDV S1 enhances immunity with superior neonatal protection”的最新研究论文。本研究基于腺相关病毒（AAV）载体构建了一种重组疫苗（rAAV-CMV-PEDV S1），旨在通过优化疫苗设计，突破传统疫苗的局限，为 PED 的防控提供新的解决方案。 IF：6.5    中科院2区  |  JCR/Q1 疫苗参考译文：表达PEDV S1的重组AAV疫苗可增强免疫反应，为新生仔猪提供更优保护第一作者： Maonan Pang通讯作者：  Yin WangI 主要研究结果1.rAAV-CMV-PEDV S1病毒粒子的构建、表征和基于基因组的定量研究通过三质粒共转染HEK293T细胞，成功包装出rAAV-CMV-PEDV S1病毒颗粒。电镜显示病毒呈典型二十面体结构，直径约22 nm。IFA与Western blot证实其感染细胞后可高效表达PEDV S1蛋白。因无CPE，建立靶向基因组的绝对定量qPCR标准曲线（Y=−3.221log₁₀N+36.441，R²=0.999，E=104.4%），测得纯化病毒滴度为1.86×10¹⁰ vg/mL，为后续免疫评价提供精准剂量依据。图1. 重组AAV载体（rAAV-CMV-PEDV S1和rAAV-CMV-EGFP）的设计、构建和表征2.rAAV-CMV-PEDV S1疫苗在小鼠模型中激发了稳健和持续的体液细胞免疫，其具有比灭活疫苗更优越的上级CD 8 + T细胞活化在小鼠模型中，rAAV-CMV-PEDV S1疫苗单次肌注即可诱导显著高于灭活疫苗（P图2.rAAV-CMV-PEDV S1疫苗在小鼠模型中的双重免疫激活特征3.rAAV-CMV-PEDV S1疫苗在妊娠母猪中的安全性和耐受性在初产母猪妊娠中期单剂肌注1 mL（1×10⁹ vg）rAAV-CMV-PEDV S1后14 d内，体温曲线与综合临床评分与灭活苗、弱毒苗及DMEM对照组无差异（P>0.05）；所产仔猪平均初生重及健康比例亦一致，未见流产、死胎或畸形。全程未观察到局部或全身不良反应，证明该疫苗对母猪及胎儿均安全耐受，为母源免疫策略提供了关键安全性依据。图3.rAAV-CMV-PEDV S1疫苗在妊娠母猪和新生仔猪中的安全性评价4.rAAV-CMV-PEDV S1疫苗赋予新生仔猪天然被动免疫母猪产前34天单次肌注rAAV-CMV-PEDV S1后，初乳中抗-PEDV S1 IgG水平分别较弱毒苗和灭活苗提高1.6倍与2.3倍（P图4. rAAV-CMV-PEDV S1疫苗增强了母猪的体液免疫和仔猪的被动免疫5.rAAV-CMV-PEDV S1疫苗能在一定程度上提高母猪的细胞免疫和体液免疫免疫后27 d检测显示，rAAV-CMV-PEDV S1组母猪血清Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-β及Th2型IL-4浓度均高于灭活苗组（IL-2提升最显著，P<0.001）；与弱毒苗相比，IL-2亦显著升高（P<0.05），其余细胞因子呈上升趋势。结果表明，该疫苗可在一定程度上同时增强母猪的细胞免疫（Th1方向）与体液免疫（Th2方向），实现双重免疫调节效应。图5.用rAAV-CMVPEDV S1疫苗免疫的妊娠母猪中的血清细胞因子谱6.rAAV-CMV-PEDV S1疫苗通过被动免疫在哺乳仔猪中赋予上级保护，提高存活率并保持肠道完整性以抵抗PEDV攻击5日龄仔猪口服攻毒（10⁵ TCID₅₀ PEDV AJ1102-F12）后，rAAV-CMV-PEDV S1组平均采食评分最高、腹泻最轻，72 h肛拭子病毒载量分别比灭活苗和弱毒苗低1.4 log与0.9 log（P<0.001）；存活率达80%，显著优于灭活苗40%和弱毒苗60%（P<0.01）。病理显示该组仔猪小肠无肉眼可见病变，绒毛结构完整，而对照组出现明显充血、坏死及脱落，证实疫苗通过高滴度母源抗体为哺乳仔猪提供卓越保护并维持肠道完整性。图6.PEDV攻击后新生仔猪中rAAV-CMV-PEDV S1疫苗赋予的被动免疫保护图7.攻毒后哺乳仔猪的解剖学和显微病理学变化I 研究总结研究构建的rAAV-CMV-PEDV S1疫苗单次免疫即可在小鼠和母猪体内诱导高滴度、持续20周以上的抗PEDV S1 IgG，并显著激活CD8⁺ T细胞应答，同时提升初乳中和抗体与IgA水平，实现体液-细胞双重免疫优势。疫苗对妊娠母猪及新生仔猪安全耐受，无局部或全身不良反应；通过高效母源抗体转移，使仔猪获得显著高于传统疫苗的天然被动免疫，为田间母源免疫策略提供关键数据。攻毒试验证实，该疫苗使哺乳仔猪存活率提升至80%，显著降低病毒载量并完全保持小肠绒毛完整性，在保护效力上全面超越商用灭活与弱毒疫苗，展示rAAV平台防控PEDV的广阔应用前景。源论文链接：https://doi.org/10.1038/s41541-025-01248-0 Article