近日，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所在口服亚单位疫苗递送技术方面取得重要进展，成功开发出一种新型、通用且低毒性的细菌仿生囊泡（BBVs）口服疫苗递送技术。相关研究成果于近日发表在《细胞外囊泡杂志（Journal of Extracellular Vesicles）》。目前，猪群普遍存在多种细菌和病毒的混合感染，因此疫苗联合免疫策略备受关注。亚单位疫苗因其安全性而被广泛应用。相比肌肉注射，口服免疫不仅能为猪只提供黏膜免疫，还能降低应激反应，但口服递送抗原面临胃肠道破坏和免疫原性弱的挑战。为此，研究团队通过改造猪霍乱沙门氏菌弱毒株的Lipid A结构来降低其内毒素活性，进一步利用其BBVs作为疫苗递送载体，并通过引入SpyCatcher/SpG双抗原耦合系统和多糖涂层（壳寡糖，COS）以实现多抗原的口服递送。该研究首先以mCherry为抗原模型，评估了该载体口服递送抗原的潜力。结果表明，COS涂层显著减少胃肠液对抗原的破坏，提高抗原在肠道和淋巴组织的靶向递送能力，并有效诱导M1型巨噬细胞极化。随后，使用该递送载体“模块化”展示了猪链球菌2型菌株的谷氨酸脱氢酶（GDH）和伪狂犬病病毒的gD蛋白，口服免疫小鼠后可有效激发体液、黏膜和细胞免疫。在相应病原的致死性攻击时，该疫苗为免疫动物提供了良好的保护。该研究为递送口服亚单位疫苗提供了新技术，为防控多病原感染提供了新思路。猪蓝耳病与伪狂犬病研究创新团队博士研究生沈雪刚为论文的第一作者，杨勇博副研究员、安同庆研究员和蔡雪辉研究员为共同通讯作者。该研究得到了“十四五”国家重点研发计划、黑龙江省自然科学基金重点项目、中国农业科学院基础研究科学中心项目和中国农业科学院高产高效技术集成与示范推广项目等资助。原文链接：https://doi.org/10.1002/jev2.70207

环指蛋白4（RNF4）是一种转录因子，在小鼠的睾丸中表达很高，可与雄激素受体互作。有研究者研究显示，RNF4蛋白作为一种转录协调子，在颗粒细胞、卵细胞及精细胞的发育过程中发挥着重要的调控作用。因此选择RNF4做为影响繁殖性状的候选基因。1 材料与方法1.1 材料猪的耳组织统一放在-20℃保存备用。1.2 方法1.2.1 引物的设计与合成  根据RNF4 基因DNA序列设计引物，退火温度为59.1℃。1.2.2 PCR扩增  PCR扩增后，可见937 bp的清晰目的条带。1.2.3 限制性内切酶酶切（RFLP）  PCR产物经内切酶酶切后，观察其分型结果。2 结果与分析2.1 猪RNF4基因的多态位点检测当多态位点为TC基因型时，可见3个片段（937 bp+545 bp+392 bp）；当多态位点为TT基因型时，可见一个片段（937 bp）（图1）。猪RNF4基因SacII酶切分型结果图1  猪RNF4基因SacII酶切分型结果2.2 猪RNF4基因的基因型和等位基因的频率分布发现RNF4基因经过SacII酶切后，在三个猪群中，C等位基因占优势（表1）。2.3 猪RNF4基因三个基因型与猪所有胎次产仔数性状的关联分析通过在淮猪新品系Ⅱ猪群体中分析发现，CC型个体的所有胎次产仔数显著高于TT型个体1.044头（P＜0.05），C等位基因为优势等位基因。详见表2。3 讨论RNF4基因在颗粒细胞、卵细胞及精细胞的发育过程中发挥着重要的调控作用，并发现，RNF4基因的CC基因型在所检测的3个猪群中占优势，这与其他研究者的结果是一致的。所以，在今后的猪的选育初期，可以参考选择RNF4基因的CC型个体作为一个选留参数，以期提高猪的产仔数。

近日，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所揭示了E3泛素连接酶TRIM45引导细胞自噬系统精准清除流感病毒PB2蛋白的分子机制，相关研究成果发表在《PLoS Pathogens》杂志上。自噬是一种高度保守的细胞内降解途径，通过溶酶体系统实现对胞质成分的降解与再循环。根据底物向溶酶体递送方式的不同，可分为三种类型：巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬（CMA）。已有研究表明，巨自噬在流感病毒的复制周期中扮演重要角色。然而，另一种选择性自噬形式—CMA是否参与流感病毒的复制调控，仍不清楚。该研究发现，TRIM45通过增强CMA途径底物受体LAMP-2A表达及PB2与LAMP-2A互作，促进了CMA介导的PB2降解，从而抑制病毒复制；同时，TRIM45的E3泛素连接酶活性介导蛋白酶CAPN1发生K48泛素化修饰并被蛋白酶体降解，阻止CAPN1对LAMP-2A的切割，进而保持CMA功能完整性。进一步研究表明，PB2蛋白602-606位高度保守的QMRDV基序是PB2结合LAMP-2A并经CMA降解的关键，该基序引入Q602A突变不仅使TRIM45失去介导PB2经CMA途径降解的能力，而且导致病毒在小鼠体内生长滴度和致病力显著提高。该研究阐明了TRIM45通过CMA途径降解PB2蛋白以拮抗流感病毒复制和致病的分子机制。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所博士生王一涵和研究员姜丽为论文第一作者，李呈军研究员和陈化兰院士为共同通讯作者。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、黑龙江省自然科学基金等项目资助。原文链接：https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013630

 近日，中国农业科学院上海兽医研究所动物寄生虫与生物媒介控制团队利用基因编辑技术获得了一种“减毒不减产”的转基因球虫株，展现出优异的疫苗应用潜力。相关研究成果发表在《国际生物大分子杂志（International Journal of Biological Macromolecules）》上。  面对耐药性挑战，对球虫病的免疫预防虽已成主流，但传统活疫苗因存在毒力返强风险而应用受限。基因编辑疫苗凭借其精准调控成为研发新方向，而球虫遗传操作复杂、致病机制不清等问题，制约着高效疫苗抗原的筛选，是当前研发面临的核心瓶颈。  该研究通过基因编辑技术，成功构建了稳定过表达微线体蛋白的转基因球虫株。与亲本株相比，该虫株在致病性显著降低的同时，繁殖能力提升61.0%。免疫攻毒试验证实其具有优异的免疫保护效果。该研究揭示了微线体蛋白调控球虫的多种表型，证实了通过精准调控关键蛋白表达可实现球虫“减毒不减产”，获得兼具低致病性、高免疫原性与良好繁殖性能的候选疫苗株。该研究成果不仅为开发新型球虫病疫苗提供了可靠的技术路径，其建立的基因编辑与表型评估体系也为其他顶复门原虫研究提供了新思路。  该研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金等项目支持。（通讯员 俞仓炜）原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2025.148361

摘要：本文回顾了全球牛传染性胸膜肺炎（也称牛肺疫）历史流行情况，简述了部分国家牛肺疫消灭史，总结了全球牛肺疫防控成效及进展，分析了全球牛肺疫流行状况及特点。迄今为止，欧洲、北美洲和大洋洲已经彻底消灭了牛肺疫，全球已有24个国家被世界动物卫生组织（WOAH）认可为无牛肺疫国家；2005—2022年，全球共有34个国家（非洲32个、亚洲2个）累计报告疫情4 727起，发病动物365 506头/只；亚洲的马来西亚和沙特阿拉伯存在疫情散发，非洲撒哈拉以南地区是主要流行区域；总体看，全球牛肺疫流行趋势趋缓，特别是近年报告疫情的国家数量和疫情数都大幅下降。此外，本文还简述了我国牛肺疫消灭史。牛传染性胸膜肺炎（contagious bovine pleuropneumonia，CBPP，又称牛肺疫）是由丝状支原体丝状亚种（Mycoplasma mycoides subsp. Mycoides，Mmm）引起的一种高度接触性传染病，临床主要表现为厌食、发热和呼吸症状（如呼吸困难、呼吸急促、咳嗽和流涕等），病变特征为渗出性纤维素性肺炎和浆液性纤维素性胸膜肺炎。牛肺疫的易感动物主要是牛，包括普通牛（Bos taurus）和瘤牛（Bos indicus），亚洲水牛和牦牛也有被感染的报道，绵羊和山羊也能被自然感染。迄今已知人不易感，因此牛肺疫无公共卫生风险。牛肺疫的潜伏期通常为3~8周。牛肺疫主要通过易感动物与被感染动物直接接触而传播，也可通过吸入被感染动物呼出的飞沫传播。牛肺疫具有高度传染性，流行时发病率高，死亡率可高达50%，曾在许多国家的牛群中发生并造成重大经济损失，曾是危害全球养牛业的3种主要疫病之一（其他2种为牛瘟和口蹄疫），是世界动物卫生组织（WOAH）规定的须通报动物疫病，是我国农业农村部规定的一类动物疫病，也是我国继牛瘟之后宣布消灭的第二种动物疫病。全球牛肺疫历史流行状况GO ALL OUT FOR牛肺疫流行历史非常悠久。据文献记载，早在16世纪，欧洲就有了牛肺疫的报道。18世纪下半叶，该病在欧洲大陆广泛传播，后通过殖民活动和活牛贸易传播到世界大部分地区。19世纪，牛肺疫又传入美国、澳大利亚、加拿大以及非洲等地。19世纪末，澳大利亚又成为新的疫源地，将牛肺疫进一步传播到新西兰、印度、中国、蒙古国、朝鲜和日本等国家。20世纪以来，欧洲、美洲和大洋洲国家采取了扑杀、免疫等综合措施，基本消灭了该病，目前牛肺疫主要流行于非洲撒哈拉以南国家。欧洲欧洲是牛肺疫的起源地，最早于16世纪出现疫情；到18世纪下半叶，牛肺疫已在欧洲大陆不少国家流行；19世纪，由于拿破仑战争和国际贸易发展，欧洲地区活牛贸易数量攀升，导致牛肺疫在欧洲大陆迅速传播，最先在荷兰和瑞士暴发疫情，随后传入英国。20世纪20年代以后，欧洲通过禁止牛只流动、扑杀发病的同群牛和接种疫苗等方法，在西欧绝大多数地区扑灭了牛肺疫，但法国和西班牙的边境地区仍有牛肺疫散发，部分国家也多次复发疫情。如：葡萄牙消灭牛肺疫30年后，1983年疫情复发且广泛流行，直到1999年才得以控制；西班牙继1961年发生牛肺疫后，1989年疫情复发，直到1994年才被扑灭；法国继1967发生牛肺疫后，分别于1980、1982、1984年又发生疫情；意大利消灭牛肺疫100年后，1990年疫情复发，直到1993年才被再次消灭。据不完全统计，历史上欧洲共有25个国家报告发生过牛肺疫，但这些国家通过采取扑杀、免疫接种、移动控制等措施，先后消灭了牛肺疫，近20余年来再未发生（表1）。北美洲据不完全统计，历史上北美地区的美国和加拿大两个国家发生过牛肺疫。1843年牛肺疫首次传入美国，至1876年加拿大消灭牛肺疫时，该病仍在美国广泛流行。1879年英国因牛肺疫限制从美国进口牛，因此1884年美国成立了畜牧局（美国兽医机构前身），决定着手消灭牛肺疫。1887年，该局被授权购买和销毁患病动物，并于1889年开始实施检疫；通过临床识别、消除疑似病例以及对场所进行消毒等措施，美国于1892年消灭了牛肺疫，此后再未发生。牛肺疫是19世纪下半叶在北美地区消灭的第一种疫病，且是在没有诊断试验或疫苗的帮助下消灭的。大洋洲据不完全统计，历史上大洋洲地区仅有澳大利亚和新西兰两个国家发生过牛肺疫。1859年，牛肺疫通过从英国进口的牛传入澳大利亚，此后从澳大利亚又传入新西兰。1864年后，新西兰再未发生牛肺疫疫情，而疫情在澳大利亚却持续流行。澳大利亚各州采取染疫动物识别、染疫动物屠宰、屠宰场监测、免疫接种和移动控制等诸多措施，部分州逐渐控制和消灭了牛肺疫。如到1914年，维多利亚州几乎消灭了牛肺疫。1959年，澳大利亚决定进行牛肺疫消灭工作。1968年，联邦政府建立了一套统一的标准体系，划分了疫区、保护区和无疫区，采取有效措施控制和消灭牛肺疫，1968年之后澳大利亚再未发生疫情。1973年，澳大利亚宣布消灭了该病。非洲历史上，牛肺疫传入非洲后持续流行，至今非洲仍是全球牛肺疫最主要流行地区。1854年，牛肺疫从英国和荷兰传入南部非洲，19世纪末又通过从印度进口感染牛传到埃塞俄比亚和苏丹，随后传播到东非和西非。20世纪70—80年代，由于使用疫苗，一些国家的疫情有所控制，但随后受干旱、战争等因素影响，牛肺疫在撒哈拉地区再次呈现地方性流行，并呈加重趋势。如：坦桑尼亚在长达25年未发生疫情后，1990年疫情复发，1995年在全国大暴发；1995年，卢旺达也重新暴发牛肺疫疫情；1939年，博茨瓦纳消灭了牛肺疫，但1995年疫情再次暴发，在扑杀了32万头牛后，直到1995年底疫情才被彻底扑灭。据不完全统计，历史上非洲地区共有30多个国家发生过牛肺疫，迄今仅有安道尔、埃及、南非、博茨瓦纳等极少数国家消灭了牛肺疫，而多数国家仍有牛肺疫流行。亚洲19世纪末，牛肺疫从澳大利亚传入亚洲。据不完全统计，历史上亚洲地区共有印度、巴基斯坦、阿富汗、缅甸、越南、柬埔寨、孟加拉、马来西亚、日本、蒙古国、朝鲜、中国、阿联酋、卡塔尔、科威特、沙特阿拉伯、以色列、也门、约旦和黎巴嫩等20个国家发生过牛肺疫疫情。至今亚洲多数国家已数十年未再出现疫情（表2）。自2005年以来，亚洲地区仅有沙特阿拉伯和马来西亚2个国家报告发生牛肺疫疫情，但有关文献认为亚洲地区有些国家的牛肺疫状况并不清楚。近年全球牛肺疫流行状况和特点GO ALL OUT FOR2005年以来总体流行状况根据WOAH-WAHIS数据统计，2005—2022年全球累计有34个国家报告发生过牛肺疫疫情，累计报告疫情4 727起，累计报告发病动物365 506头/只，死亡30 182头/只（表3）。除亚洲的马来西亚和沙特阿拉伯分别报告发生3起和2起牛肺疫疫情外，其余32个报告牛肺疫的国家均是非洲国家。其中，2005—2022年累计报告牛肺疫疫情数量居前5位的国家分别是加纳、埃塞俄比亚、尼日利亚、多哥和坦桑尼亚，分别报告疫情921、821、301、299和297起，合计占全球疫情总数的56.9%。从报告的病例数来看，刚果（金）最多，达237 544例，占全球总病例数的65.0%；其他报告病例数过万的国家还包括埃塞俄比亚、坦桑尼亚、尼日利亚和安哥拉，分别报告26 405、25 169、18 423和10 585例，这4个国家的病例合计占全球总病例数的22.1%。2005年以来全球牛肺疫流行特点本世纪以来，欧洲、北美、大洋洲等历史上牛肺疫流行严重的地区已彻底消灭牛肺疫，迄今再未复发疫情；亚洲地区多数国家也已控制牛肺疫，仅有马来西亚和沙特阿拉伯报告散发疫情；非洲地区的牛肺疫则一直未得到有效控制，特别是撒哈拉以南地区多数国家的牛肺疫仍呈地方性流行，是近年来全球牛肺疫的主要流行区域。但从最近几年流行情况看，牛肺疫发病国家数量大大减少，疫情数大幅下降，流行总体上呈减缓趋势。时间分布　2005以来，全球报告的4 727起牛肺疫疫情中，2 703起是上半年（1—6月）报告的，2 024起是下半年（7—12月）报告的，分别占57.2%和42.8%，上半年报告的疫情数略多。其中，2008年报告疫情数最多，共509起，而2012年报告发病的国家数量最多，达24个。从各年发病国家数量和疫情数来看，均呈现先增加后减少趋势（图1）。如发病国家数量在2005—2017年总体呈增加趋势，发病国家数量大体在20多个，而在2018—2022年则呈大幅下降趋势，2020、2021和2022年报告发生牛肺疫的国家仅分别有9、7和3个；除2008年报告的疫情数最多外，2005—2019年全球每年报告的疫情数总体呈上升趋势，2019年达到了436起；2020—2022年则显著下降，分别报告110、58和41起疫情。空间分布　2005—2022年报告发生牛肺疫疫情的34个国家中，除马来西亚和沙特阿拉伯2个亚洲国家外，其余32个国家都是非洲撒哈拉以南国家，占全部发病国家数的94.1%，报告的疫情数占全球总疫情数的99.9%。其中，西非、东非、中非和南非地区发病国家数量分别为14、9、6和3个，累计报告疫情数分别为2 306、1 516、438和462起，各占全球总疫情数的48.8%、32.1%、9.3%和9.8%，说明2005—2022年总体上西非、东非地区比中非、南非地区流行更严重。但自2020年以来，非洲发病国家数量和疫情数急剧下降，发病范围已大幅缩小。2020—2022年，累计有9个非洲国家报告发生牛肺疫疫情，累计报告疫情206起，其中西非、东非、南非和中非地区发病国家数量分别为3个（科特迪瓦、尼日尔和尼日利亚）、3个（埃塞俄比亚、苏丹和索马里）、2个（纳米比亚和赞比亚）和1个[刚果（布）]，累计报告疫情数分别为82、78、36和10起。此外，2020年亚洲的马来西亚报告发生3起牛肺疫疫情，17头肉牛和水牛被感染；沙特阿拉伯也曾在2005年报告发生过2起牛肺疫疫情。群间分布　2005—2022年，全球报告的365 506例牛肺疫病例中，涉及的感染动物主要包括牛、水牛、绵羊/山羊、犬和野生动物等5大类。其中，绝大多数国家报告的是牛病例，合计365 031例，占全球总病例数的99.87%；乌干达（2005年）、坦桑尼亚（2019年）和马来西亚（2020年）等3个国家报告了水牛牛肺疫疫情，发病水牛合计13头；沙特阿拉伯（2005年）、安哥拉（2008年）、苏丹（2009年）、坦桑尼亚（2018年）和乍得（2018年）等5个国家在牛肺疫疫情中报告了绵羊/山羊病例，合计报告病例461例，死亡117例；尼日利亚（2009年）报告1例犬病例；卢旺达（2010年）报告了野生动物病例，2只野生动物死亡。全球牛肺疫防控进展GO ALL OUT FOR通过采取免疫、扑杀、移动控制、屠宰场监测等一系列措施，欧洲、北美洲和大洋洲地区已彻底消灭了牛肺疫，亚洲地区多数国家也多年未发生疫情，呈地方性流行的非洲撒哈拉以南地区近年发病国家数量和疫情数也大幅降低，全球牛肺疫防控成效显著。截至目前，全球已有24个国家被WOAH认可为无牛肺疫国家（图2），包括阿根廷、斯威士兰、秘鲁、澳大利亚、法国、葡萄牙、玻利维亚、印度、俄罗斯、博茨瓦纳、意大利、新加坡、巴西、墨西哥、南非、加拿大、蒙古国、瑞士、中国、新喀里多尼亚、美国、厄瓜多尔、巴拉圭和乌拉圭。此外，纳米比亚和赞比亚的牛肺疫官方控制计划也获得WOAH支持。为了进一步改善和协调全球牛肺疫控制政策，2016年联合国粮食及农业组织-世界动物卫生组织-非洲联盟非洲动物资源局-国际原子能机构（FAO-OIE-AU/IBAR-IAEA）牛肺疫咨询小组第五次会议提出了未来控制牛肺疫的协调行动政策建议，总体目标是改进和协调牛肺疫控制措施，具体目标包括提升控制措施效果、实施控制干预措施、改进诊断和治疗方法以及研发新疫苗等，并提出了分阶段实施计划和未来10年消灭牛肺疫的关键点。其中，第一阶段为综合推广控制阶段，为期3~5年，主要任务是评估状况，并制定和实施区域和国家战略；第二阶段是积极控制阶段，为期5~7年，在此期间各国积极开展监测（特别是屠宰场监测），并对执行情况持续进行评估改进。相信未来在这些政策建议指引下，全球的牛肺疫控制政策、措施会更加适用、有效，全球牛肺疫状况会更加改善，牛肺疫控制进程推进会更快。我国牛肺疫消灭情况GO ALL OUT FOR1918年，牛肺疫从北部传入我国，此后在我国东北、西北、西南、华北大范围流行，曾给我国养牛业造成了巨大经济损失。我国自20世纪50年代成功研制一系列牛肺疫弱毒疫苗后，采取以免疫和扑杀相结合的综合性防控措施，经过数十年努力，有效控制了牛肺疫的流行，到1989年后再未发生疫情，取得了消灭牛肺疫的巨大成就，并于1996年宣布消灭了牛肺疫。2011年，我国被WOAH认可为无牛肺疫国家，至今持续维持无疫状态。近年来，全球牛肺疫防控成效显著，疫情主要在非洲撒哈拉以南地区流行，亚洲地区发病国家极少。但由于我国的动物及产品进口需求旺盛，国际交往以及边贸活动频繁，再加上亚洲地区有些国家的牛肺疫状况不明，这些因素对我国的无牛肺疫状况维持构成潜在威胁。为此，当前仍需重视并持续做好牛肺疫防控相关工作，从而维持我国的无牛肺疫状况地位。一要继续落实好进口风险控制，强化国际疫情监视，禁止从牛肺疫感染国家/地区进口牛科动物及其产品，强化活牛及其产品进口风险分析，对进口活牛及其产品按照有关标准实施严格检疫、隔离和消毒等措施，有效降低进口传入风险；二要加强边境地区牛肺疫防控，加强边境地区动物疫病防控基础设施建设，强化部门联防联控，严厉打击活牛及其产品走私活动，防止牛肺疫从边境地区传入；三要持续开展牛肺疫监测，包括临床监测以及血清学、病理学和病原学监测，加强牛肺疫相关知识宣传培训，提升基层对牛肺疫疑似病例的识别和报告能力，发现疑似病例及时采集样品送检；四要做好有关技术研究和储备工作，优化和研发现场快速诊断方法，改进和研究高效优质疫苗，做好应急储备。

摘要：为了解攀西地区蜱种类及蜱源立克次体的种类和感染状况，采用形态学和PCR方法，对随机采集自攀枝花和凉山州部分地区牛羊体表的252只蜱进行种类鉴定；利用特异性引物对立克次体ompA、gltA基因片段进行PCR扩增，随机选择阳性样本进行测序，并对测序序列进行分析，构建系统发育树。经种类鉴定，攀西地区存在微小扇头蜱和褐黄血蜱2种蜱种；蜱携带立克次体平均阳性率为29.37%（74/252），存在敬信立克次体暂定种（Candidatus Rickettsia jingxinensis）、立克次体共生菌（Rickettsia endosymbiont of Rhipilephalus microplus）、马赛立克次体（Rickettsia massiliae）共3种立克次体，其中敬信立克次体暂定种为优势种，共检出31份。不同县市的蜱携带立克次体阳性率不同，其中盐源县和昭觉县未检测到立克次体，而布拖县（57.14%）、西昌市（55.26%）阳性率较高；牛、羊体表蜱携带的立克次体阳性率分别为29.55%（26/88）和29.27%（48/164），差异不显著。结果表明，攀西地区存在多种蜱传立克次体，其分布范围较广，蜱携带率较高。结果提示，当地应做好蜱传立克次体病的防控，减少其对人和家畜的危害。立克次体是一类以蜱为主要传播媒介的病原微生物，是专性寄生于真核细胞内的革兰氏阴性原核生物，介于细菌与病毒之间，较接近于细菌，在蜱虫体内可经卵垂直传播给下一代，通过叮咬可水平传播给宿主，引起多种人兽共患病。在遗传进化史上，立克次体主要分为斑疹伤寒和斑点热群立克次体。目前我国流行的立克次体至少有10种，包括日本立克次体（Rickettsia japonica）、黑龙江立克次体（Rickettsia heilongjiangensis）、立克次体XY99（Rickettsia sp. XY99）、拉乌尔立克次体（Rickettsia raoultii）、西伯利亚立克次体BJ-90亚种（Rickettsia sibirica subsp. BJ-90）等。近几年我国又发现了几种新的蜱传立克次体，如Candidutus Rickettsia jiaonani、Rickettsia erhaii等。随着新的立克次体不断被发现，该病原逐渐受到了更多学者的重视。我国已先后从黑龙江、新疆、内蒙古、北京、福建、海南、广东、云南、广西、四川等省（区、市）的蜱中检测到立克次体。Yuan等在我国云南、广西、广东等地检测到新型立克次体GD01株，总阳性率为12.5%（71/569）。Zhang等报道我国四川省苍溪县主要流行两种立克次体，总体阳性率为33.5%（63/188）。随着调查研究深入，我国多地发现蜱携带立克次体，且其流行范围广，潜在危害大。攀西地区位于四川省西南部，山场广阔，河谷光热资源丰富，这为动植物的生长发育提供了优良环境，同时也给蜱类孳生提供了条件。本地区牛羊以放牧为主，因此增加了牛羊被蜱叮咬的概率和感染蜱传病原的风险。目前关于攀西地区蜱的区系分布及蜱传立克次体感染情况的调查研究报道较少。为了解攀西地区蜱传立克次体的流行情况，对采集自攀西地区的蜱进行种类鉴定和立克次体分子检测，以期为攀西地区蜱传立克次体病的综合防控提供依据。材料与方法蜱类采集与处理2021年6月至2022年3月，在凉山彝族自治州和攀枝花市，随机选择牛羊，共采集其体表的蜱252只，其中西昌市38只（羊源10只、牛源28只）、盐源县23只（牛源）、美姑县30只（羊源）、木里县19只（羊源）、会东县21只（羊源）、布拖县7只（羊源）、昭觉县7只（牛源）、普格县7只（牛源）、米易县40只（羊源）、盐边县60只（羊源），编号标记后保存于1.5 mL离心管中待检。主要仪器及试剂冷冻混合球磨仪（MM400），德国莱驰公司产品；电泳仪（JY600E），北京君意电泳仪科技有限公司产品；SDS-PAGE凝胶成像系统，美国伯乐GelDocXR+公司产品；银制PCR仪（Nexus GSX）、高速离心机（5810R）、冰箱（U725）、可调微量移液枪，均为德国艾本德公司产品；试剂主要有：2×EasyTaq PCR superMix、DL 2 000 DNA Maker、TBE（tris-硼酸电泳缓冲液）、核酸染料、生理盐水等。基因组DNA提取首先对蜱进行观察，根据邓国藩等主编的《中国经济昆虫志.硬蜱科》进行初步形态学鉴定；然后将蜱虫洗净放入1.5 mL离心管中（如为成蜱可剪取一半），用干净的剪刀将蜱虫剪碎后加入200 μL灭菌生理盐水，再向离心管中加入4粒钢珠，研磨8 min及以上；取出钢珠后，按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA并置于-80 ℃冰箱保存。蜱种类分子鉴定根据已发表文献对蜱虫16S rRNA进行扩增，引物序列见表1。PCR扩增体系（25.0 μL）：2×EasyTaq PCR superMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，引物T16SP1和T16SP2各1.0 μL，模板1.0 μL。PCR扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s、50 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，共38个循环；72 ℃ 6 min。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，所得到的阳性样本进行切胶送生物公司测序，通过序列比对确定蜱种类。立克次体基因扩增及鉴定采用郭利萍报道的引物，扩增外膜蛋白A编码基因（ompA）；采用高悦等报道的套式PCR引物，扩增立克次体柠檬合成酶编码基因（gltA）。以上引物均由上海杰李生物有限公司合成，引物序列见表2。PCR扩增体系（25.0 μL）：2×EasyTaq PCR superMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板1.0 μL。ompA基因扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、46 ℃ 30 s、72 ℃ 35 s，共35个循环；72 ℃ 6 min。gltA基因第一轮扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 80 s，共35个循环；72 ℃ 5 min。第二轮扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，选取阳性产物送至生工生物工程（成都）有限公司双向测序。立克次体gltA、ompA测序序列分析将测序得到的立克次体gltA、ompA基因片段，经拼接剪切后通过Blast进行同源性比对，下载同源性较高的序列作为参考序列，同时下载不同种立克次体的同源基因序列，利用MEGA-X通过Maximum Likelihood法构建系统发育树，并设置自举值为1 000。数据统计立克次体感染情况用Excel软件分析。对不同地区、不同宿主的蜱携带立克次体阳性率，利用SPSS 21.0软件进行卡方检验。当P＜0.05时，差异显著即存在统计学意义；P＞0.05时，差异不显著。结果蜱虫种类鉴定对252只蜱虫先进行形态观察鉴定，再通过PCR扩增16S rRNA基因，经过1%琼脂糖凝胶电泳，发现电泳条带与目的条带（460 bp）基本一致（图1）。阳性样本测序结果经Blast比对，确定为微小扇头蜱和褐黄血蜱。立克次体PCR扩增PCR扩增结果经1%琼脂糖凝胶电泳后得到的目的条带均与预期目的片段（ompA为510 bp，gltA为381 bp）大小一致（图2），分别扩增出74份ompA基因和11份gltA基因阳性样本。ompA基因序列分析及系统发育树构建　共有29个阳性样本ompA基因测序成功，进行剪切后序列长度约为486 bp。ompA基因片段序列同源性分析显示：主要存在两种斑点热立克次体序列，样本BTY227序列与我国陕西省长角血蜱体内检测到的敬信立克次体暂定种（Candidatus R. jingxinensis，MH932061）同源性为100%（483/483 bp），XCY98与微小扇头蜱中检测到的立克次体共生菌（Rickettsia endosymbiont of Rhipicephalus microplus，MN537556）同源性为100%（486/486 bp）。以Rickettsia akari为外群，基于ompA基因构建的系统发育树（图3）显示：BTY227与敬信立克次体暂定种聚为一支，亲缘关系近；XCY98与立克次体共生菌聚为一支，亲缘关系近，且与马赛立克次体、扇头立克次体有较近的亲缘关系。gltA基因扩增结果分析及系统发育树构建　共有11份阳性样本gltA基因测序成功，序列长度约为366 bp。gltA基因片段序列同源性分析显示：主要存在两种斑点热立克次体序列，样本BTY227与从我国南方微小扇头蜱体内分离的敬信立克次体暂定种（Candidatus R. jingxinensis，MW114883）同源性为100%（366/366 bp），MYY86与从意大利血红扇头蜱体内分离的马赛立克次体（R. massiliae，KJ663741）同源性为99.73%（365/366 bp）。以Rickettsia bellii为外群，基于gltA基因构建的系统发育树（图4）显示：BTY227与敬信立克次体暂定种聚为一支，亲缘关系近；MYY86与马赛立克次体聚为一支，有较近的亲缘关系。蜱传立克次体感染率统计不同种类　从采集的252份蜱样品中，共检出立克次体74份，总体阳性率为29.37%（74/252）。共检出31份敬信立克次体暂定种（Candidatus R. jingxinensis），其中西昌牛源9份、米易羊源5份、普格牛源2份、会东牛源6份、美姑牛源5份、木里羊源1份、布拖羊源3份；检出立克次体共生菌（Rickettsia endosymbiont of Rhipicephalus microplus）2份，均为西昌羊源；检出马赛立克次体（R. massiliae）1份，为米易羊源。由此推断，敬信立克次体暂定种为攀西地区立克次体优势种。不同采集地　本次采集的蜱来自10个县市，不同采集地的蜱携带立克次体阳性率不同。ompA基因检测结果（表3）显示：布拖阳性率最高，为57.14%，其次为西昌55.26%，会东42.86%；经卡方检验，10个县市中，排除未检测到立克次体的盐源、昭觉后，剩余8个县市的蜱携带立克次体阳性率 差异显著（P = 0.023，＜0.05）。gltA基因检测结果（表3）显示：同样是布拖阳性率最高，为28.57%，其次为普格14.29%、美姑13.33%；经卡方检验，10个县市中，排除未检出的县市，不同县市的蜱携带立克次体阳性率差异不显著（P = 0.611）。不同宿主　从总体来看，不同牛羊来源蜱携带的立克次体阳性率相近，其中牛源蜱携带的立克次体阳性率为29.55%，羊源蜱携带立克次体阳性率为29.27%（表4）。经卡方检验，牛、羊宿主蜱携带的立克次体阳性率差异不显著（P = 1.000）。但在西昌市，蜱携带的立克次体情况与宿主有显著差异（P = 0.009），而在美姑县，蜱携带立克次体情况与宿主无显著差异（P = 0.708）。讨论因蜱的发育经历了卵、幼蜱、若蜱、成蜱，因此通过形态学观察需要鉴定人员具有丰富的经验，因此分子学鉴定更受广大学者青睐。用于蜱分子生物学鉴定的基因主要有16S rRNA、COI、COII、ITS-1、ITS-2。16S rRNA基因序列高度保守，因此常作为蜱种类鉴定靶基因。攀西地区幅员辽阔，地理、气候等特点适合蜱生活繁衍。而该地区蜱的区系分布调查仍处于空白。本检测发现，微小扇头蜱为攀西地区的优势蜱种，并分布有褐黄血蜱。该结果与姚晓燕等对我国微小扇头蜱分布情况的总结相符。攀西地区位于川南，与云南省接壤且与其气候特点类似，也属于微小扇头蜱生长的中高适生区。目前针对蜱携带立克次体的检测方法多样，但用于流行病学调查的仍以分子生物学检测方法为主，包括普通PCR、巢式PCR、实时荧光定量PCR及自杀式PCR（suicide PCR）。主要的靶基因有16S rRNA、柠檬合成酶基因（gltA）、外膜蛋白A基因（ompA）、外膜蛋白B基因（ompB）以及细胞表面抗原1（sca1）、细胞表面抗原4（sca4）、17 kDa蛋白抗原等编码基因。其中ompA与ompB对斑点热群立克次体有较好的特异性及鉴别性，即不同斑点热群立克次体，其ompA表现出种的特异性，对斑点热群立克次体的基因型、亚型鉴定及分类具有重要意义，此外ompA基因还可以准确把握斑点热群立克次体的遗传变异特征。唐天才报道四川省石渠县斑点热立克次体总阳性率为49.48%，盛悦报道内蒙古斑点热群立克次体总阳性率为37.7%。而本研究发现，攀西地区蜱携带立克次体阳性率为29.37%，低于上述两个地区。攀西地区作为四川省的西部城市群，有发展农牧业得天独厚的优势，属于典型的半农牧地区，相比纯牧区的内蒙古及石渠县，其立克次体阳性率的差异可能与蜱种类分布及气候、海拔等自然条件不同有关。蜱虫传播需要借助宿主来完成，例如依靠鸟类迁徙、牲畜贸易等。攀西地区各地交通不便，蜱虫传播途径受限，导致各地区蜱种类及数量有差异，进而导致其携带的立克次体阳性率不同。此外，采样过程中经咨询牧民与养殖户得知，不同地区不同养殖户的驱虫意识参差不齐，导致个别地区蜱虫孳生，蜱携带的立克次体阳性率较高。不同宿主蜱携带的立克次体阳性率差异不显著，这与该地区蜱虫无差别叮咬有关，而个别地区阳性率差异显著可能与牛羊养殖模式不同等因素有关。本研究证实，攀西地区存在3种立克次体，其中敬信立克次体暂定种为优势种，其与Guo等报道的陕西省长角血蜱体内敬信立克次体暂定种序列（MH932061）同源性高达100%；且系统发育树显示，两个地区的立克次体处于同一分支。以上表明，敬信立克次体暂定种可能是国内多个地区的立克次体优势种，需要重点加强对其流行的控制。马赛立克次体与斑点热感染有关，首次于法国扇头蜱属体内被发现。Wei等首次在国内西北部的新疆伊犁县图兰扇头蜱体内检测到马赛立克次体，其蜱携带率为3.50%（4/114）；Guo等在西北部塔克拉玛干沙漠图兰扇头蜱体内检测到马赛立克次体，蜱携带率为1.71%（2/117）。本检测发现，微小扇头蜱的立克次体携带率为0.40%（1/252），与上述结果基本相符，存在低携带率现象且都发现于扇头蜱属。综上，攀西地区存在发生立克次体病的潜在威胁，应重视蜱传立克次体病预防。目前攀西地区乃至凉山彝族自治州均缺乏系统的蜱种检测及蜱传立克次体的分析与研究。凉山州及周边多为少数民族群居，天然放牧为主的饲养方式使得人们与自然及牲畜接触增多，被蜱叮咬的概率较大，蜱传立克次体病发病风险较高。因此，当地应做好对牛、羊等家畜的驱虫工作，避免在蜱虫活动高峰期放牧，采取相应防护措施，防止被蜱虫叮咬。各县市应设立哨点医院，重点监测、控制和治疗蜱传立克次体病，做好宣传，提高群众防范意识，以保证公共卫生安全及畜牧业有序发展。

摘要：2020年10月发生外源性牛结节性皮肤病疫情后，内蒙古自治区积极开展流行病学调查和广泛的疫情排查，对疫点实行了封锁、检疫、隔离、扑杀及无害化处理等综合性防控措施，对受威胁区域进行了全面的疫苗免疫，并定期进行检疫和排查。通过采取有效的防控和监督保障措施，使疫病在短期内得到灭源与根除，为当地养牛业健康发展提供了坚实保障。本文从疫病发生与防控过程、监督保障措施、所存问题等方面进行论述，提出了完善相关政策法规和健全检疫监管体系，强化进口及跨省流动动物监管，提升动物疫病防控能力等措施建议。牛结节性皮肤病（lumpy skin disease，LSD）是由痘病毒科山羊痘病毒属牛结节性皮肤病病毒（LSDV）引起的牛全身性感染疫病，2020年农业农村部印发的《牛结节性皮肤病防治技术规范》将其定为二类动物疫病管理。2019年8月，在我国新疆维吾尔自治区首次确诊发生LSD疫情。自2020年10月发生疫情后，内蒙古积极有效应对外源性传入疫病，采取强有力的防控措施和监督保障，使LSD在短期内得到灭源与根除，为养牛业健康发展提供了坚实保障。疫病的发生与防控疫病的发生发病时间　2020年10月，内蒙古锡林郭勒盟西乌珠穆沁旗在动物防疫督察中发现，巴彦胡硕苏木舒图嘎查75头进口牛皮肤出现大面积多发疙瘩样结节症状，伴有体温升高，部分结节破溃结痂，临床疑似LSD。该批牛由智利引进，在江苏省连云港海关隔离场隔离期满后即调入内蒙古。内蒙古自治区动物疫病防控机构立即采集皮肤结节、口鼻拭子和抗凝血样品送检，3 d后，经中国动物卫生与流行病学中心确诊为LSD。疫点分布　内蒙古此次共引进同批次牛3 400头。其中，调入锡林郭勒盟2 974头，涉及5个旗区（其中西乌珠穆沁旗1 039头、正镶白旗130头、正蓝旗1 320头、阿巴嘎旗58头、乌拉盖管理区427头）；调入包头市426头，涉及九原区某牧业有限公司。6个旗区均出现LSD疫情，大部分疫点分布在锡盟。辐射范围　锡林郭勒盟5个旗区引进牛中陆续有964牛头发病，发病率为32.4%；死亡49头，病死率为5.1%；涉及15个苏木乡镇、36个嘎查、89个农牧户。首先发现疫情的西乌珠穆沁旗共进口该批牛1 039头，发现可疑病例273头。包头市九原区某牧业有限公司发病牛9头，发病率为2.1%，无死亡。采样诊断　对所有发病牛采样送内蒙古自治区动物疫病预防控制中心（以下称自治区疫控中心）进行LSDV核酸检测（荧光PCR方法），结果检出LSD阳性。上述地区的发病牛和病死牛均为同批进口牛，疫情未向外扩散，当地其他牛未见发病和死亡现象。防控措施启动应急预案　发病旗区政府紧急启动应急预案，自治区、盟市及相关旗县立即安排防控经费，用于疫情处置、物资购置、疫苗免疫、疫情排查监测和监督保障。自治区疫控中心发布了《内蒙古自治区牛结节性皮肤病防治技术指南》，指导防控工作，农牧部门第一时间派出专家组和技术人员赴发病苏木嘎查、养殖场开展疫情处置和流调。及时处置疫情　确定为外源性疫情后，锡林郭勒盟5个旗区共检测样品3 004份，扑杀并无害化处理发病牛和检测阳性牛1 887头；包头市九原区共检测样品426份，扑杀并无害化处理发病牛和检测阳性牛120头。开展疫苗免疫　按照《牛结节性皮肤病免疫技术规范》对高风险区域的牛进行紧急免疫。锡林郭勒盟动物疫情应急指挥部下发了《关于抓紧组织开展牛结节性皮肤病紧急免疫工作的通知》，对高风险区域苏木乡镇所有47.1万头牛进行了紧急免疫；包头市对九原区存栏的22 095头牛全部进行了紧急免疫。各地均研判疫情，对防控效果开展风险评估，创建并推广综合防控集成技术模式，适时开展牛的疫苗免疫。全方位开展流调　按照《农业农村部关于做好牛结节性皮肤病防控工作的紧急通知》要求及内蒙古自治区农牧厅的工作部署，全区各盟市迅速开展了LSD流调工作，特别针对近年来进口和区外调入的牛。同时，每年结合春秋两季防疫在全区范围内开展专项流调，到目前未发现新发LSD。监管保障监督疫情旗区划定疫点、疫区在自治区督导组和专家组的指导下，各旗区严格按照防治技术规范要求，精准划定疫点、疫区，采取隔离、消毒、检测、扑杀及无害化处理等防控措施，全力处置疫情。监督消毒灭源，消杀传播媒介，净化饲养环境督促养殖场户重视对传播媒介蚊、蝇、蠓、虻、蜱等叮咬昆虫及幼虫的消杀，清除孳生环境。掌握对当地昆虫媒介生物种类、采食习惯、活动规律及叮咬吸血习性，对现有媒介携带病毒及存活方式和危害季节进行调查，最大限度地阻断昆虫媒介的传播途径。建立定期消毒制度，各地将环境消毒灭源作为防疫的常态化工作。疫点病牛扑杀和无害化处理后，对所接触的器具、垫料、饲料、污水及其排泄物、分泌物等同时进行无害化处理，对养殖场地、棚圈及环境进行清洁和消毒。锡林郭勒盟5个旗区累计消毒面积431.311万m2；包头市九原区累计消毒面积13.39万m2。对检测阴性牛实施隔离监管锡林郭勒盟5个旗区和包头市九原区扑杀并无害化处理发病牛和检测阳性牛后，对现存栏的1 344头同批次牛实行了严格隔离。当地动物疫病防控机构指派专人实施定点隔离监管，保障隔离条件，改善隔离场环境条件，做好消毒和消杀昆虫，按时观察牛体健康状况，在隔离期满后，进行再次采样送检，确保疫病彻底消除，消除再感染隐患。实施封锁和限制高风险地区动物流动疫区旗区都在疫点、疫区出入口设置检查站卡，禁止易感动物及产品进出，在锡林郭勒盟设立了26个、在包头市九原区设立了1个消毒检查站。同时，关闭了辖区内的活牛交易市场，对隔离动物下发限制动物移动执法文书，限制高风险地区易感动物向低风险地区流动。各地还建立了有效的疫情巡查和奖励机制，对及时发现疫情和未经检疫购入外地易感动物的举报人员进行奖励，查出了一批违法违规调运牲畜的案件。严格进口牛检疫监管自治区出台规定，要求进口动物须符合中国与输出国政府签订的动物检疫条款和检疫要求，相关材料齐全。进口牛须经临床健康检查、检测阴性、疫苗免疫，凭海关有效检验检疫证明方可引进。动物运抵后24 h内，向所在地旗县级动物卫生监督机构报告，由官方兽医现场查验、核对耳标信息、登记备案后，进行监督隔离观察，隔离观察期满经检疫合格后方可混群饲养。全区各地按规定开展了进口牛专项检查，共检查进口牛15 312头。其中，呼和浩特市组成检查组对所辖4个旗县、11个奶牛场2020年以来进口的4 600头奶牛的购入手续、检疫凭证、免疫消毒记录、养殖档案、健康状况等进行了详细的检查，未发现LSD相关症状的奶牛。精准落实监管责任、开展广泛疫情排查各地制定任务清单，将责任分解落实，按照属地管理的原则，对辖区内牛免疫、备案、调运、检疫、健康状态等进行拉网式摸排。全区LSD疫情排查实行日报制，截至2021年底，全区累计排查养殖场户232.8万个次、屠宰厂636个次、交易场所293个次，排查牛4 136.5万头次。其中，锡林郭勒盟累计排查苏木乡镇2 425个次、养殖场户2 289个次，排查牛855.2万头次；包头市累计排查苏木乡镇318个次、养殖场户2 435个次，排查牛63.42万头次。加强检疫和流通环节监管自治区疫控中心下发了《关于进一步规范动物检疫工作的通知》，严格产地检疫、屠宰检疫的出证、验证和规范管理，落实跨省调运种用乳用动物检疫审批，跨省调时运调运人须持有“动物检疫合格证明”及实验室检测报告，到达目的地后，向所在地旗县级动物卫生监督机构报告。同时，加大对贩运经纪人和运载车辆管控，实行动物贩运经纪人备案登记制度，在新增的“牧运通”模块中开发应用车辆备案系统，实现了畜禽运输备案车辆和动物检疫电子出证的关联，并采集出证后的备案车辆轨迹，达到检疫证明和畜禽运输轨迹同步保存。并根据农业农村部活畜检疫调运反馈信息，对进入内蒙古运输牛的车辆及启用地和运输目的地与当地有关的车辆进行追踪和排查，发现疑似症状时严格按照防治技术规范处置；供屠宰用动物进入的，必须“点对点”调运到屠宰场，调运途中不得卸载。实行报批和指定通道制度部分地方，如锡盟行署下发了《关于加强动物调入监督管理的公告》，实行调入牛报告批准、盟市级报备制度，动物运抵后24 h内现场勘验，监督隔离观察。规定了两处公路进入的指定通道（太仆寺旗检查站和多伦县检查站）负责监督检查、信息登记、车辆消毒和签章。任何单位和个人不得接收未经指定通道动物卫生监督检查站检查、消毒、签章输入的动物和动物产品。依托信息平台精准施策自治区在检疫出证和落地监管等信息化建设中统筹协调、健全数据，对奶牛规模养殖企业实行了畜禽标识可追溯管理，奶牛规模养殖企业将关联信息录入自治区兽医信息化管理系统，并通过动物检疫电子出证系统对跨省区和区内调运的动物进行平台跟踪巡查及到达确认，将启运地出证与目的地反馈实现无缝衔接，有效推进了互联互通，实现了产地与运输环节的全链条监管。疫情处置中发现的问题牛只调运频繁，疫病发生风险增大，进口动物未严格落实落地监管制度此批进口牛是由政府牵头，农牧民与进出口企业签订合同引进的。牛只在海关隔离期满后，被运输至目的地，但未向当地动物卫生监督部门报告，也未实施查验和观察，而是将牛分散到了各购牛场户，造成疫点数显著增多，波及面广的被动局面。基层动物卫生监督机制落实不到位机构改革后，各地动物卫生监督执法机构受到合并、重组、整合、减编等因素影响，人员和经费严重不足，是目前制约动物卫生监督工作的一大难题。养殖场户和基层兽医对新发病识别不够，未及时发现和报告疫情，从发病牛抵达目的地到巡查发现疫情已有半月之久。进口动物隔离监管存在疏漏初步调查引进牛来源国为LSD无疫状态，进口牛到港时全部健康，疑似是在进口后隔离场隔离时染疫的，同批次牛调运至不同地方均有发病，在隔离期满时已有个别牛出现病症，但未引起足够重视。外源性疫病大面积突发，增加疫病防控压力一是隔离同群引进的阴性牛所需的隔离场往往是因地制宜，隔离条件不完全达标；二是在幅员辽阔、道路四通八达的牧区旗县实施疫区封锁和限制高风险地区动物移动方面操作难度大。跨部门间的协调联动及联防联控存短板目前，动物进口隔离期满后对国内调入地如何实施及时有效的跟踪监管仍缺少明确的规定和信息共享，凭海关开具的检验检疫证明即可移动调运动物，到达地落地报告制度难以实施，不能形成监管的及时性和连续性。另外，疫情发生后在追责和及时打击违法违规调运动物方面也应加大同公安等部门的协作配合。对策健全法律法规，加强能力建设应汲取此次外源性疫病发生的教训，完善相关政策法规，健全检疫监管体系，加强基层动物卫生监督的能力建设，落实辖区范围内动物调运流动巡查监管责任，疏通疫情报告渠道，做到疫病早发现、早处置。强化对进口及跨省调运动物的监管严把进口动物检疫关，执行有效的准入和报备制度，加强行业间及部门间的工作协调和信息共享，严格执行抵达目的地的及时监管。对于违法、违规调运动物引发动物疫情的案件要协同海关、公安等部门严厉打击。进一步提升疫病综合防控能力特别要加强基层动物疫病防控基础性设施建设，完善动物疫病应急处置机制，提升实验室诊断水平，建立布局合理、政府主导的动物隔离场和无害化处理厂，达到疫病处置与扑灭的标准化和规范化。进一步明确机构和体制理顺各地动物卫生监督执法的机构和名称，尽量做到统一归口、上下一致、权责明晰、协同联动。要加强执法队伍的建设，配备与监督管理工作相适应的执法人员，提高人员素质，并加大对动物卫生监督执法的经费投入，保障经费投入渠道畅通，并满足执法工作的需要。加强宣传培训通过培训、印发宣传单、挂图等多种方式，加大对养殖、经营、屠宰等相关从业人员疫病防控知识的普及，提高其对LSD的识别能力，帮助其掌握防控要点，增强其自主防范意识，做到群防群控。

摘要：生物传感器是由生物学、电化学、光学与信息科学等多学科交叉融合发展形成的一种传感新技术，具有成本低、操作简单、准确度高、专一性强等优点，被广泛应用于生物医学、食品工业、环境监测等领域，并为动物疫病检测提供了一种快速有效的新途径。目前生物传感器主要分为酶生物传感器、免疫生物传感器、微生物传感器、细胞生物传感器以及DNA生物传感器，每种生物传感器各有其优缺点及适应场合。近年来，生物传感器在动物疫病检测方面的应用逐渐成为研究热点，研究多聚集于禽流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、非洲猪瘟等病毒性疾病，沙门氏菌病、猪链球菌病等细菌性疾病，以及血吸虫病、弓形虫病等寄生虫病。未来生物传感器与新兴学科领域或新型材料的结合将进一步提高其检测效率、实用性和适用性。近年来，随着我国畜牧业的不断发展，动物疫病呈现一定的上升趋势。尽管疫苗和生物安全措施能够对动物疫病起到一定的防控作用，但动物疫病一旦发生，会对动物健康、动物源性食品安全、人民健康及生态环境造成一定影响。因此，建立行之有效的动物疫病检测技术，及早准确发现疫病，对于控制动物疫病的进一步传播，促进畜牧业稳定健康发展，保护人类健康安全具有重要意义。目前用于动物疫病检测的技术主要有病原分离与培养、酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光试验（IFA）和聚合酶链式反应（PCR）等，但是这些传统的诊断技术对操作人员和仪器要求较高，信号读取和检测所需时间较长，因而不利于疫病的早期诊断。生物传感器是由生物敏感元件与换能器件组成的分析装置，能够与生物特异性结合，产生与反应中分析物浓度成比例的可测量信号，具有稳定性好、灵敏度高、选择性强的特点。近年来，生物传感器被广泛应用于医疗、农业、环境监测和食品等行业，在兽医领域的应用也不断增加。随着动物疫病诊断技术的不断发展，生物传感器作为即时检测、长期监测动物疫病的设备，逐渐成为众多研究者关注的热点。本文通过阐述生物传感器的原理、分类及在动物疫病检测领域的应用，以期为生物传感器在相关领域的进一步开发应用提供理论支撑。生物传感器组成及原理生物传感器这一概念最早于1962年由Clark团队提出，他们将葡萄糖氧化酶（GOD）固定化后与氧电极组装在一起，开发了一种用于葡萄糖检测的氧化酶电极。这项研究为生物传感器发展开启了新篇章。生物传感器由被分析物、分子识别元件、换能器、电子处理器及显示器五部分组成，其中分子识别元件和换能器是最重要的两个部分。分子识别元件又称敏感元件，一般为生物受体，能够有效识别被分析物的分子，可分为经典识别元件（酶、组织、细胞、DNA和抗体等）和新型识别元件（脱氧核酶、亲和体、噬菌体、核酸适配体以及分子印迹聚合物等）；换能器又称信号转换器，可以将生物分子识别后产生的信号转化为等量的可视或可读信号，从而对目标物进行定量分析。生物传感器工作原理：待测物质经扩散作用进入分子识别元件，经分子识别作用与分子识别元件特异性结合，产生物理/化学反应；传感器将接收到的物理/化学反应信号转化为可测量的电、光、声音、温度等信号，并对产生的信号进行放大、处理并输出（图1）。测量到的信号可以间接反映待测物质的浓度。生物传感器分类生物传感器分类方式较多：根据使用的传感器器件检测原理分为电化学传感器、压电传感器、光学传感器、热传感器和声学传感器；根据待测物质与分子识别元件的结合方式分为亲和型、代谢型或催化型生物传感器；根据生物识别元件不同，可分为酶生物传感器、免疫生物传感器、微生物传感器、细胞生物传感器以及DNA生物传感器。其中，以不同生物识别元件分类的生物传感器应用较广，其原理及特点如表1所示。此外，不同类型的生物传感器可以相互组合使用，这样能够有效提高生物传感器的检测灵敏度及特异性。酶生物传感器酶生物传感器是基于酶与其底物之间起反应起作用的一类生物传感器，分为底物检测和酶抑制两个主要机制。酶生物传感器应用较为广泛，可用于食品成分和添加剂分析，以及尿液中葡萄糖、尿素及动物产品中兽药残留的检测等。Ang等将葡萄糖氧化酶（GOD）-壳聚糖膜复合物修饰在铂工作电极上，构成了电化学酶生物传感器，用于水果中的葡萄糖含量检测。该生物传感器具有良好的稳定性，与商业化葡萄糖测定试剂盒对比发现两种方法无显著差异，但在2个月后该生物传感器仅保留了36%的初始活性。Amor-Gutiérrez等将低成本的镀金连接器应用到生物传感器上。该生物传感器具有制作成本低的优势。Bidmanova等构建了一种用于检测卤化环境污染物的酶生物传感器。用1,2-二溴乙烷和3-氯-2-（氯化钾）-1丙烯对该生物传感器进行验证，结果显示线性相关性良好，检出限分别为0.133和0.014 mmol/L。该生物传感器为卤化环境污染物的持续现场监测提供了一种快速有效的检测方法。微生物传感器微生物传感器是一种将微生物与传感器集成在一起，通过微生物和目标化合物之间的相互作用，将转导器产生的信号与分析物浓度相关联从而实现检测的一类生物传感器。微生物中含有多种酶，作为识别元件，稳定性好，使用寿命长，但同时其选择性和灵敏度受到限制。近年来，大量的微生物传感器应用于环境、食品和生物医学等领域。Liang等开发了一种乙醛光学微生物传感器，能够对环境中乙醛进行检测，检测限可达0.33 μm，具有极好的底物特异性；与色谱法相比，该方法操作简单，稳定性好，性价比高。刘晓晓等构建了基于微生物燃料电池的微生物传感器，可用于对水环境中重金属污染监测，对重金属离子的检测效果相对稳定高效，重复性良好。Khan等利用葡萄糖/半乳糖结合蛋白（GBP）的突变体构建了一种可以用于检测血糖浓度变化的荧光传感器，与传统方法相比，该生物传感器不仅不受体内电活性物质干扰，还能够持续监测患者体内血糖变化情况。免疫生物传感器免疫生物传感器是利用抗原和抗体之间的特异性识别功能研制的一种生物传感器。该传感器的关键在于要将抗体固定在检测器表面，并且抗体类型要根据选择特性及合成方式来确定。Ren等利用分离的高亲和力载体蛋白E特异性N-溴代丁二酰亚胺，建立了一种对阿尔兹海默症临床诊断和实时检测的免疫生物传感器。该传感器可以配合影像设备及分析软件使用，实现图像数据化分析，因其操作简单，在落后地区有潜在的应用价值。孔壮等研发了一种电化学免疫生物传感器。该传感器能够实时了解体内激素含量，灵敏度高，成本低，最低检测限为1 mIU/mL，检测时间可控制在10 min。该传感器弥补了免疫生化检测仪器检测成本高、时间长的不足，可应用于现场快速检测。DNA生物传感器DNA生物传感器是由序列特异性探针和信号换能器组成的分析设备。该传感器以固定在信号转换器界面的DNA探针作为识别元件，探针识别目标DNA后，经信号转换器将信息转换为可以分析测量的信号，从而实现对目的DNA的检测。Shakoori等开发了一种检测乙型肝炎病毒（HBV）的电化学生物传感器。该传感器在区分互补DNA、非互补DNA序列和错配DNA序列方面有良好的特异性和灵敏度，目的DNA序列的最低检出限为2.0×10-12 mol/L。在此基础上，Mohsen等将电化学技术、纳米技术与生物传感器结合，构建了能够在较低浓度下以无标记方法检测乙型肝炎的高灵敏DNA生物传感器，检测限可达到1 fmol/L，大幅提高了传感器的灵敏度、选择性及可区分性。Ohk等设计了一种基于抗体和适配体的光纤DNA生物传感器，将其用于食品中单核细胞增生李斯特菌检测。证明抗体和核酸适配体的结合具有高度的特异性，能够实现单核细胞增生李斯特菌的快速检测。细胞生物传感器细胞生物传感器是利用固定化活细胞作为生物识别元件，通过分析换能器产出的信号强度与被分析物之间关系来实现检测目的的一种装置。细胞传感器根据细胞类型可以分为微生物细胞和动物细胞两大类。Tian等构建了一种基于精子细胞的生物传感器，该传感器采用小鼠活精子细胞作为主要敏感元件，细胞内钙离子荧光探针（Fluo4-AM）作为传感器，与流式细胞术结合，实现对苦味化合物的快速定量检测。该传感器特异性高，检出限低，且操作简单，价格低廉，弥补了传统检测方法成本高、个体变异大等缺点，能够为制药、食品工业和生物安全等多个领域的苦味物质综合评价提供一种新的、高效的方法。Sun等开发了一款基于微流控细胞的生物传感器。该传感器由毫秒化学脉冲发生器和表达内源性P2Y受体的NIH-3T3细胞作为传感元件，并采用脉冲方式引入样品，能够实现对液体环境中的ATP检测，最大限度地减少受体的脱敏，延长传感器使用时间。生物传感器在动物疫病检测方面的应用病毒性疾病禽流感　禽流感（AI）是由禽流感病毒（AIV）引发的一类疾病，其中高致病性禽流感引起的死亡率高，传播速度快，给养殖业带来巨大的经济损失。AIV可在宿主体内长期存在，具有高度的遗传变异性。Dong等建立了一种基于DNA四面体纳米结构的电化学生物传感器。该传感器能够与H7N9 AIV的目标ssDNA杂交，实现H7N9 AIV的快速检测，还可以特异性地从其他类型的病毒（如H1N1和H3N2流感病毒）以及寡核苷酸的单基错配中识别H7N9 AIV的靶DNA片段，对H7N9 AIV目标核苷酸序列的检测限可达100 fmol/L，具有较大的应用潜力。Wong等首次提出了使用相强表面等离子体共振（SPR）生物传感器。该传感器在探测表面等离子激发时，P偏振光和S偏振光之间会产生陡峭相位变化，使传输的光束从传感器的表面旋转并通过偏振片对传输，在检测器上识别相应强度变化，分辨率为6.3×10-6 RIU，相较于干涉测量的相位SPR传感器和普通强度SPR传感器分辨率高出一个数量级，可应用于H5N1 AIV抗体生物标志物检测，其检出限为193.3 ng/mL。Park等通过病毒融合机制，开发了细胞模拟纳米颗粒（CMPs），可以在发病早期利用高致病性AIV（HPAIV）和低致病性AIV（LPAIV）在血凝素（HA）蛋白裂解上的差异实现对HPAIV和LPAIV的鉴别诊断，相较于仅能检测AIV的快速试剂盒，灵敏度更高。而且，Park等探测病毒融合活性的方法证明了AIV具有感染宿主细胞的能力。猪繁殖与呼吸障碍综合征　猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS），又称猪蓝耳病，由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）引起。怀孕母猪和仔猪对PRRSV最易感，感染后表现为呼吸障碍和繁殖障碍，皮肤发绀，双耳皮肤变蓝，肺部病变严重呈弥漫性间质性肺炎，是全球养猪业面临的严重威胁之一。Kuitio等开发了一种适配体生物传感器。与传统的PRRS诊断方法相比，该方法更加快速准确，特异性和选择性较高，耗时短，可直接检测病毒颗粒，但检测限为1.87×1010个PRRSV颗粒，灵敏度还有待改进。Liu等构建了一种氧化石墨烯（GO）改进的SPR生物传感器，用于检测培养细胞中的PRRSV，相较于传统的检测技术，该生物传感器可以实现病毒的无损实时动态检测，对于研究病毒与生物分子或抗病毒药物的相互作用具有重要意义。非洲猪瘟　非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）所引起的猪和野猪的急性、发热、高死亡率的传染性疾病，其发病机制复杂，防控难度大，给养猪业带来了极大经济损失。Li等选择截断的p54蛋白作为抗原，并与掺杂铕的荧光微球偶联，结合横向流动检测（LFA）技术，快速、可视化检测ASFV抗体。该方法特异性较好，且检测结果与ELISA试剂盒一致。为了提高检测的灵敏度，Li等构建了基于抗体双量子点微球（QDM）的ASFV免疫传感器，可用于血清中ASFV抗体的检测。与ELISA和胶体金免疫层析试纸条方法相比，该生物传感器更加稳定和灵敏，其定量分析性能也得到一定程度的提高。细菌性疾病沙门氏菌病　沙门氏菌病是由沙门氏菌引起的一类常见的人兽共患病，不仅危害人类健康，还会给畜牧业带来巨大经济损失。畜禽感染沙门氏菌可引起相应的传染病，如鸡白痢、猪霍乱等。而沙门氏菌血清型众多，传播方式复杂，传统检测方法难以实现沙门氏菌的有效检测。Sridapan等研制了一种基于双层环介导等温扩增结合侧向层析技术的生物传感器，用于生产中弯曲杆菌和沙门氏菌的快速检测，其灵敏度较高，但检测易受到气溶胶污染。Ying等开发了一种利用杂交链式反应（HCR）进行信号放大的核酸横向流生物传感器（LFNAB）。该传感器检测合成DNA的检出限为1.76 pmol/L，沙门氏菌检出限为3×103 cfu/mL，无需酶、标签或复杂的设备。猪链球菌病　猪链球菌病是一类危害较大的人兽共患病，主要表现为脑膜炎、心内膜炎、败血关节炎等，哺乳仔猪和断奶仔猪多发，一旦发病，会对养殖业带来较大经济损失。其中，猪链球菌2型毒性较强，引起的发病率较高。Wang等提出了一种基于模拟双酶和L-半酰胺酸信号放大策略的猪链球菌2型的检测方法。该方法利用L-半酰胺酸与空心双金属合金纳米粒子相互作用形成纳米复合材料，能够大大增强过二硫酸氢酯的电化学发光（ECL）信号。与传统生物酶相比，该传感器在灵敏度、重复性及选择性方面等具有显著优势，为ECL生物传感器信号放大提供了一种新方法。Ju等利用柠檬酸钠还原金盐，与猪链球菌2型多克隆抗体偶联制备胶体金，建立了一种用于检测猪链球菌2型抗原的免疫层析试纸条方法，其敏感性可达106 CFU/mL。该方法具有可视化、高特异性等优点，可用于猪链球菌2型抗原的现场即时检测。寄生虫病血吸虫病　血吸虫病是一种广泛流行但被高度忽视的寄生虫病，一般通过接触受感染的水，使得血吸虫幼虫透过皮肤而引起感染。血吸虫病目前虽然在大多数地区得到了控制，但为了实现降低发病率和最终消灭血吸虫的目标，做好监测和早期诊断是重中之重。He等建立了一种检测日本血吸虫循环抗原的金纳米棒光学传感器。该传感器不仅弥补了传统病原生物学和免疫学方法无法对血吸虫病进行早期诊断的不足，还可用于血吸虫病患者血清的分析。Santos等构建了一种基于巯基苯甲酸（AMB）自组装单分子膜的高灵敏度电化学基因传感器。该传感器将金纳米粒子（AuNPs）和磁铁矿纳米粒子（Fe3O4-NPs）固定在AMB上，用电化学阻抗谱（EIS）和循环伏安法（CV）监测杂交过程，从而提高了检测方法的灵敏性和特异性。弓形虫病　弓形虫病是由弓形虫引起的一种人兽共患病，发病率高，可造成牛、羊等怀孕家畜流产及猪死亡，给畜牧业带来巨大经济损失。Sousa等利用金纳米颗粒的光学特性，建立了一种针对弓形虫GRA6抗原的检测方法。该方法相比于ELISA等经典方法，显示出更好的敏感性和特异性。张玉娟以重组的tSAG1作为诊断抗原，建立了基于tSAG1的纳米棒生物传感器和金纳米簇模拟酶可视化生物传感器。该传感器简化了反应系统，增强了可视化功能，降低了分析成本，能够用于弓形虫病诊断。小结及展望生物传感器相较于传统方法，具有智能化、可视化、微型化和功能多样化等优势，与智能化系统的结合，可以实现数据的自动采集、处理及分析，减少主观判断造成的误差。当前，生物传感器在动物疫病检测方面的应用不断增加，不同生物识别元件与电化学技术联用、纳米材料的应用及酶复合物的构建，缩短了检测时间，大大提高了生物传感器的特异性、亲和力和抗干扰能力。但是现有的生物传感器仍然存在一些问题，例如，双层环介导等温扩增结合侧流生物传感器在操作过程中易出现假阳性，酶生物传感器检测效果随着酶活性降低而发生变化，DNA生物传感器易出现碱基错配等。随着技术水平和工艺的不断提高，生物传感器与新兴学科领域或新型材料的结合，将进一步提高其检测效率、实用性和适用性，在动物疫病检测与防控领域会有更广阔的应用前景。《生物传感器概述及其在动物疫病检测中的应用》详情请点击“阅读原文”。

兽用多西环素是广谱四环素类抗生素，核心联合价值在于覆盖混合感染（细菌+支原体/附红细胞体） 和增强对顽固菌的抑制效果，需严格遵兽医指导使用。一、简要介绍1、关于多西环素的药物特点：①多西环素物理性状：为黄色（浅黄色）粉末状药物，味苦，具有抗菌高效、毒性较低、抗菌谱较广、吸收率高且快的特点；②多西环素抗菌机制：多西环素经猪只口服给药吸收→进入细菌细胞→作用于细菌核糖体30S亚基→干扰细菌蛋白质合成→使其无法正常生长繁殖→起到速效抑菌效果；③多西环素在同类兽药（四环素类）中的抗菌强度比较：多西环素＞四环素＞金霉素＞土霉素，所以说，多西环素称之为四环素类抗生素中的“领头羊”当之无愧，也是仅次于氟苯尼考的最常用的兽药品种之一；多西环素的脂溶性高，抗菌强度高于土霉素强2-4倍，常见为粉剂，针剂少见，且对猪的刺激性较大；④多西环素的抗菌谱和应用：多西环素属于超广谱的抗生素之一，抗菌谱包括猪只常见的G+性菌、G-性菌、立克次体、猪密螺旋体、猪支原体（猪气喘）、猪原体（母猪流产）、猪附红细胞体（猪多发性溶血）、部分原虫，（概括为二菌+四体+一虫）；多西环素对G+性菌的抗菌敏感性高于G-性菌，如猪葡萄球菌感染、猪化脓性链球菌、猪肺炎球菌、放线菌所致的呼吸道炎症和软组织感染；2、兽用多西环素的使用注意事项：①兽用多西环素在碱性环境中易分解，在酸性环境中更稳定；②多西环素不宜与含铝、镁、钙、铁等金属离子的饲料或药物一起使用；③多四环素在拌料给药：适当在饵料表面喷撒少许油脂，可提高猪只肾小管对药物的重吸收率，从而提高药效；④多西环素在猪只体内存在肝肠循环机制：多西环素在猪只体内通过胆汁排入肠道→在肠道内吸收后回到肝脏→重新存贮至胆囊→再次排入肠道，从而提高药物半衰期；⑤猪只长期使用多西环素，会导致二重感染：猪肠道有益菌群失活导致消化系统减弱、肝损伤和维生素B、维生素K缺乏症；⑥强力霉素属于速效抑菌型抗生素：不可与速效杀菌性抗生素如青霉素类（包括阿莫西林）、头孢类一起使用，以免降低药效；二、核心联合用药方案（附药效逻辑）1. 与大环内酯类联用（针对“细菌+支原体”混合感染）搭配药物：泰乐菌素、替米考星、阿奇霉素。药效特点：多西环素覆盖革兰氏阳性菌（如链球菌）、阴性菌（如大肠杆菌）及附红细胞体；大环内酯类专攻支原体（如猪气喘病、鸡慢呼病原体），二者联用同时解决呼吸道混合感染的双重病因，是畜禽呼吸道疾病（如猪传染性胸膜肺炎、鸡败血支原体病）的经典方案。此外，多西环素与泰妙菌素、大环内酯类抗生素（如替米考星、泰万菌素）、同类四环素类药物之间联用，治疗猪顽固性呼吸道和其他疾病也有较好效果；2. 与磺胺类药物联用（增强对顽固菌/原虫的疗效）搭配药物：磺胺间甲氧嘧啶钠（SMM）、磺胺氯达嗪钠。药效特点：多西环素抑制细菌蛋白质合成，磺胺类阻断细菌叶酸代谢，二者作用于细菌不同代谢环节，形成“协同抑菌”，显著提升对附红细胞体病、弓形虫病、萎缩性鼻炎（多杀性巴氏杆菌）等顽固感染的治愈率。风险提示：需同时补充维生素B族，避免磺胺类药物导致的肠道菌群失衡。3. 与氟苯尼考联用（针对耐药性阴性菌感染）搭配药物：氟苯尼考（酰胺醇类）。用于猪大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、传染性胸膜肺炎放线菌、猪支原体所致的猪呼吸道疾病、母猪生殖系统炎症、全身性感染和败血症，治疗范围较广，且更适合中大猪使用。药效特点：多西环素对部分耐药阴性菌（如副猪嗜血杆菌）有基础抑制作用，氟苯尼考对耐药阴性菌的杀灭效果更强，二者联用针对重症肠道/呼吸道感染（如猪副猪嗜血杆菌病、牛巴氏杆菌病），尤其适用于单一用药效果不佳的场景。风险提示：氟苯尼考有免疫抑制作用，幼龄畜禽（如仔猪、雏鸡）需控制剂量。三、药效特点（独有的用药优势）1. 广谱性强：对革兰氏阳性菌、阴性菌、支原体、衣原体、附红细胞体、弓形虫等均有效，适配多种混合感染场景。2. 体内分布广：能穿透血脑屏障、胎盘屏障，且在肺部、肠道、关节液中浓度高，特别适合治疗呼吸道、肠道及全身性感染。3. 长效性：半衰期长（猪体内约12-18小时），可减少给药次数（如每日1次），降低应激。4. 耐药性风险：长期或滥用易产生耐药性，需避免单独作为预防性用药，且不可与同类四环素类（如土霉素）交替使用。四、关键用药禁忌禁止与青霉素类（如阿莫西林）、头孢类联用：多西环素抑制细菌繁殖，会降低青霉素/头孢类“杀灭繁殖期细菌”的药效，产生拮抗。休药期严格执行：猪休药期通常为28天，鸡为7天，牛奶废弃期7天，避免药物残留。

肉类食品安全中饲料安全很关键，饲料中的霉菌毒素污染威胁饲料产品安全。近期，扬州大学 “莲芯肠安” 本科生科创团队揭示霉菌毒素相关致病机制，筛选出防控生猪霉菌毒素中毒的新策略。霉菌毒素由谷物受真菌侵染产生，仔猪饲养阶段受其影响会出现腹泻、生长停滞甚至死亡，带来经济损失。传统脱霉方法只能部分拦截毒素，还会降低饲料利用率。该团队经数百次实验，揭示霉菌毒素通过引发 “铁死亡” 致病新机制，发现核受体蛋白 RORγ 是关键 “开关” 。指导老师蔡德敏教授称，研究为下一代脱霉技术提供思路。团队锁定异莲心碱，实验证明它能激活 RORγ 阻断 “铁死亡” 进程。目前成果正在转化，核心技术已转让，未来团队计划拓展至多种畜禽养殖领域，助力构建新型饲料安全保障体系。

摘要基因定点敲入技术是基因工程和基因治疗的核心工具，旨在避免传统随机整合方法的不可控性及异质性等问题，但是在实际的应用过程中却长期受编辑过程中的脱靶活性和低效性的限制。近年来，位点特异性重组酶系统（如Bxb1整合酶）和可编程核酸酶系统（如CRISPR-Cas9）的发展显著提升了基因敲入的精确性与效率。特别是Cas9-Bxb1整合酶系统的出现，实现了5~43 kb大片段DNA在基因组安全港位点的靶向整合，为功能蛋白生物合成、疾病模型构建、基因功能研究和临床治疗提供了突破性平台。本文系统综述了位点特异性重组酶在精准医学和合成生物学中的应用研究进展。传统的基因敲入方法主要依赖质粒的随机整合或同源重组实现外源DNA的敲入，相较于同源重组方法，随机整合方法对技术的要求较低且耗时较短，因其易于操作性被广泛使用。然而，随机整合在使用过程中却被发现效果不佳，主要是因为整合位点的不可控导致转基因敲入的异质拷贝数，或敲入位置相关的高表达克隆变异，包括转基因拷贝数的丢失、染色体重排和因表观遗传调控而造成的克隆稳定性降低，进而导致后续需要繁琐的筛选流程来确定稳定和高表达克隆。研究发现，转座酶、逆转录病毒、慢病毒载体在染色体整合方面很有效，被广泛应用于基因组工程以提高敲入效率。然而，这些方法都有各自的局限性。例如，基于慢病毒载体技术尽管有效负载能力（18 kb）非常出色，但却具有遗传毒性和免疫原性。逆转录病毒和慢病毒载体倾向于整合附近的转录单位。更重要的是，上述方法均为随机整合，无法精确控制敲入拷贝数，因而难以避免异质性表达的问题。睡美人（sleepingbeauty）和piggyBac这两个最为常见的DNA转座子系统也因缺乏可编程性及在基因组中的“跳跃”特性，成为开发精准基因编辑转座子系统的重大障碍，虽然经过大量的工程改造及与CRISPR系统结合使转座子系统具有靶向性，但是脱靶活性仍然显著。在基因组编辑领域，如何实现大型DNA构建体的高效精准整合一直是亟待解决的关键科学问题。近年来，随着位点特异性重组酶系统（site-specific recombinase，SSR）及核酸酶系统（site-specific nuclease， SSN）的深入研究及应用，大基因片段整合效率得到显著提升。目前，这两种方法在基因敲入方面都具有很大应用潜力。值得关注的是，最近研究者开发了一种新的工具，将RNA引导的Cas9和位点特异性整合酶Bxb1结合起来，成功实现了5~43 kb大片段DNA的定向整合，这一技术突破不仅为构建稳定转基因细胞系提供了新工具，更在基因治疗和生物制药领域展现出广阔的临床应用前景和商业价值。本文也将就这一新技术的发展略作介绍和讨论。1 技术原理与发展脉络基因编辑领域近年来迎来了革命性的技术突破——Cas9-Bxb1整合酶联合工具箱的诞生。该系统将CRISPR-Cas9系统的可编程靶向能力与Bxb1整合酶的大片段DNA精准整合特性相结合，实现了基因组编辑从“小修小补”到“整体替换”的跨越。Bxb1作为一种来源于耻垢分枝杆菌的丝氨酸重组酶，通过识别特定的附着位点（attP/attB）实现DNA片段的不可逆单向整合，其最大优势在于近乎零脱靶活性（伪attP位点识别率<0.1%）及高达60%的整合效率。然而传统Bxb1系统存在可编程性不足的缺陷，需预先在基因组中设置识别位点，限制了广泛应用。为突破这一限制，两大研究团队分别提出了创新性解决方案：

1.1 twinPE+Bxb1系统（哈佛大学刘如谦团队）：采用两步法策略。首先利用双pegRNA引导的先导编辑器（twinPE）在基因组特定位点（如安全港相关基因座）精准插入attB识别序列；随后通过Bxb1整合酶介导携带attP位点的大片段供体DNA（可达5.6 kb）的定向整合。这一策略在Hunter综合征模型治疗中成功修复了IDS基因与假基因IDS2之间的40 kb致病性倒位，修复效率达9.6%。1.2 PASTE系统（麻省理工学院Gootenberg团队）：创造性地将nCas9切口酶、逆转录酶（RT）与Bxb1整合酶融合为单一蛋白复合物（SpCas9-RT-Bxb1），并设计改造的atgRNA引导系统。该方案能在单步反应中实现36 kb超大DNA片段在人类细胞系、原代T细胞和非分裂肝细胞中的高效整合（效率50%-60%）。其独特优势在于不依赖DNA双链断裂（DSB）修复途径，避免了由此引发的染色体结构异常风险。2 效率突破与机制解析检验尽管早期Cas9-Bxb1系统展现出巨大潜力，其整合效率仍难以满足临床应用需求。2024年，刘如谦团队通过噬菌体辅助连续进化（PACE）技术对Bxb1进行定向改造，获得了革命性突破——evoBxb1与eeBxb1两种高效变体。2.1 进化工程提升整合效率2.1.1 PACE进化平台：利用噬菌体生命周期与Bxb1酶活性的偶联，构建了“酶活性-噬菌体增殖”的正向选择系统。通过在数百代进化中施加选择性压力，筛选获得活性提升的突变体。2.1.2 evoBxb1变体：初期进化获得的突变体，在人类细胞中整合效率较野生型Bxb1提高2.7倍。机制研究表明，其活性提升主要源于DNA结合域（DBD）的S37P和R45Q突变，增强了与att位点的亲和力。2.1.3 eeBxb1变体：在evoBxb1基础上引入组合突变（包括催化结构域的D81G和E142K），形成最终的高效版本。该变体在HEK293T、N2a和HuH7细胞系中的平均整合效率达30%，较野生型提高4.2倍；在原代人成纤维细胞的COL7A1和FANCA基因座中分别实现30%和18%的整合率，较前一代PASSIGE系统提升14倍。2.2 结构机制与AI预测eeBxb1超高活性的结构基础一度是未解之谜。由于Bxb1完整多聚体结构尚未解析，研究团队采用 AlphaFold2人工智能预测模型，揭示了关键突变位于酶-DNA相互作用界面：2.2.1 D81G突变：缓解催化口袋的空间位阻，促进重组反应中DNA链转移2.2.2 E142K突变：增强与DNA磷酸骨架的静电相互作用，稳定过渡态构象这些预测通过分子动力学模拟得到验证，为后续理性设计提供了新思路。3 疾病治疗和过表达细胞株构建领域的应用突破Cas9-Bxb1工具箱的高效性和精准性为多种难治性遗传病提供了全新的治疗思路，尤其在传统方法难以应对的大片段基因替换场景中展现出独特价值。3.1 遗传病治疗新模式3.1.1 Cas9-Bxb1系统通过将完整健康基因靶向整合至基因组安全港（如AAVS1位点）或原位替换，实现“一药治百突变”的突破。Prime Medicine公司基于此技术的慢性肉芽肿病（CGD）疗法已获FDA临床试验批准，成为全球首个进入临床阶段的先导编辑疗法。3.1.2 肝脏遗传病模型：在HuH7肝细胞中，eePASSIGE介导的凝血因子IX（F9）基因整合后，表达量达野生型系统的8.7倍。白蛋白启动子驱动的hFIX分泌成功模拟生理性表达模式，为血友病B提供了符合生理调节的治疗方案。3.2 细胞疗法革新CAR-T细胞制备中，慢病毒随机整合导致的插入突变和表达异质性是长期痛点：3.2.1 原代T细胞精准编辑：PASTE系统在T细胞的TRAC位点实现PD1抗性基因（＞10 kb）的定点整合，效率＞50%。对比传统方法，修饰后的CAR-T细胞展现更持久抗肿瘤活性，且未检测到染色体异常。3.2.2iPSC疗法标准化：STRAIGHT-IN技术结合Bxb1与Cre重组酶，在人类诱导多能干细胞（iPSC）中实现170 kb超大片段的无痕整合。通过多轮重组酶处理，成功构建携带多基因回路的“通用型”iPSC库，为再生医学提供标准化细胞源。3.3 复杂结构变异修复传统基因编辑技术难以处理的染色体倒位/重复疾病迎来新希望：3.3.1 Hunter综合征治疗突破：通过twinPE在X染色体q28区同步安装反向attB/attP位点，Bxb1介导40 kb致病区域倒位修复，成功恢复IDS基因功能。该策略效率达9.6%，远高于传统HDR方法（＜0.1%）。3.3.2 大片段缺失疾病模型：在小鼠受精卵中利用Cas9-Bxb1工具箱成功构建DMD基因外显子50缺失模型，为杜氏肌营养不良研究提供精准动物模型。3.3.3 大片段多基因过表达稳转CHo细胞株的构建突破：辉瑞公司开发了一种基于Bxb1重组酶的高保真双位点整合系统，创建了CHO dBxb1宿主细胞系，能够在更短时间生产稳转细胞系。4 前沿拓展与交叉创新Cas9-Bxb1工具箱的应用已超越传统基因治疗范畴，在合成生物学、微生物组工程和农业育种等领域展现出强大生命力。4.1 合成生物学应用4.1.1 基因回路构建：在CHO细胞中利用Big-IN技术实现143 kb人工基因回路的定点整合，包含诱导型启动子、反馈抑制模块和分泌信号肽。该工程细胞株的单克隆表达变异系数（CV）＜15%，远低于随机整合（CV＞50%），大幅提升重组蛋白生产稳定性。4.1.2 染色体尺度工程：英国SynHG计划结合Cas9-Bxb1与人工智能设计，构建抗病毒染色体。通过在特定位点整合CRISPR阵列和抗性基因簇，实现染色体水平的抗病毒功能。4.1.3 功能蛋白生物合成工程：杭州景杰生物科技利用Bxb1整合酶开发了识别H3 K18la兔单克隆抗体的稳转细胞株。他们首先通过phiC31整合酶构建了带有Bxb1整合位点的CHO-S稳转细胞工程株CHO-JJ-9，然后再通过Bxb1整合酶将抗体基因转入该工程株。这种方法大幅缩短了稳转细胞株构建时间，提高了成功率，且获得的稳转细胞株都是高产量；辉瑞公司利用双位点Bxb1-RMCE构建的过表达细胞株双抗生产（Knob-into-hole）表达量11g/L，纯度98.8%。4.2 微生物组工程4.2.1 微生物基因簇克隆：清华大学朱听团队开发的CATCH技术（Cas9-assisted targeting of chromosome segments）将体外Cas9切割与Bxb1整合结合，实现100 kb微生物基因簇的高效克隆。该方案在8小时内完成靶向切割与Gibson组装，大幅加速天然产物生物合成研究。4.2.2细菌工厂优化：丹麦技术大学开发的pAblo·pCasso工具包将dCas9-Bxb1融合体与碱基编辑器偶联，在革兰氏阴性菌中实现可逆DNA编辑。通过精准调控甲羟戊酸合成途径，工程菌的番茄红素产量提升7倍。4.3 农业育种创新4.3.1 多基因叠加育种：在玉米中利用Bxb1介导的多基因叠加，实现抗虫（Bt基因）、抗除草剂（EPSPS）和耐旱（HVA1）性状的同步整合。对比传统杂交育种，周期缩短3代，且无载体骨架残留。4.3.2作物代谢通路重构：通过PASTE系统在水稻基因组“安全港”OsROC5位点整合25 kb维生素A合成通路，黄金稻品系β-胡萝卜素含量达6.5 μg/g，为解决维生素A缺乏症提供新方案。5 现存挑战与未来方向尽管Cas9-Bxb1工具箱取得显著进展，其临床转化仍面临多重挑战，亟需多学科协同创新突破关键技术瓶颈。5.1 递送技术瓶颈5.1.1 体内递送障碍：大分子编辑器（SpCas9-RT-Bxb1＞200 kDa）难以通过AAV载体（容量＜4.7 kb）递送。刘如谦团队正探索 工程化病毒样颗粒（eVLP）解决方案：5.1.2 非病毒递送策略：IDLV（整合酶缺陷型慢病毒载体）在原代成纤维细胞中实现eePASSIGE组分的高效共递送，整合效率达30%。脂质纳米颗粒（LNP）包封的eeBxb1 mRNA在小鼠肝脏显示特异性表达，为体内应用提供可能。5.2 脱靶风险控制5.2.1 脱靶整合检测：开发新型脱靶分析工具DISCOVER-Seq+，通过监测MRE11蛋白在DNA断裂位点的聚集，实现全基因组范围内脱靶事件的灵敏检测。在eePASSIGE处理的细胞中，脱靶整合率＜0.004%。5.2.2正交整合酶开发：Durrant团队从微生物组筛选发现新型重组酶Pc01与Enc9，其att位点与哺乳动物基因组同源性更低。在小鼠实验中，Pc01的脱靶率仅为Bxb1的1/20，为高安全性基因治疗提供新工具。6 结论Cas9-Bxb1整合酶联合工具箱通过融合CRISPR的可编程性和丝氨酸重组酶的高效性，突破了传统基因编辑在大片段精准整合中的技术瓶颈。从twinPE+Bxb1到eePASSIGE的技术跃迁，标志着该领域从概念验证走向临床转化的关键转折。随着递送技术、脱靶控制及伦理框架的同步完善，该技术有望在遗传病根治、细胞疗法升级、农业创新育种和合成生物学等领域释放更大潜力。原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s/RkcJL5flbPddCiXvjPCYEg

一、为什么CHO细胞是“生物制药劳模”？中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是生物制药领域的 “头号生产主力”。自1987年重组CHO细胞生产的组织型纤溶酶原激活剂首次获批上市以来，截至2014年，由CHO细胞生产的生物药占所有获批生物药的35.5%。无论是重组抗体、Fc融合蛋白等，它都能高效生产，部分产品产量甚至能达到10g/L以上。但长期以来，CHO细胞像个 “黑箱子”，由于缺乏基因组信息，人们只能靠筛选、工艺优化等经验性方法提升产量，不仅耗时耗力，还受限于产品类型。直到 2011年CHO-K1细胞基因组序列公布，加上基因编辑技术的发展，科学家才终于能“打开箱子”，从基因层面优化这个 “生产工厂”。二、CRISPR/Cas9：基因编辑界的 “瑞士军刀” CRISPR/Cas9 是近年来火遍科研圈的基因编辑工具，源自细菌的 “免疫系统”。简单来说，它就像一把精准的 “基因剪刀”：向导 RNA（gRNA）：负责 “导航”，找到目标基因；Cas9 蛋白：负责 “切割”，在目标位置制造 DNA 双链断裂；细胞自身的DNA修复机制会“缝合”断裂，要么通过易错的非同源末端连接（NHEJ）产生基因敲除，要么通过精确的同源定向修复（HDR）实现基因插入或修正。相比更早的锌指核酸酶（ZFNs）、TALENs等工具，CRISPR/Cas9 更简单、高效：只需设计特定gRNA，就能靶向任意基因，成本低、操作快，还能同时编辑多个基因。三、CRISPR/Cas9如何改造CHO细胞？ 1.敲除 “拖后腿” 的基因，提升产量和质量CHO细胞的部分基因可能限制蛋白生产或影响产品质量。比如，FUT8基因会导致抗体 “糖基化修饰” 异常，降低药效。用CRISPR/Cas9敲除该基因后，抗体的抗肿瘤活性能显著提升。研究显示，CRISPR/Cas9在CHO细胞中的基因敲除效率可达47.3%，且能同时敲除多个基因。科学家已成功构建出双基因、三基因敲除的CHO细胞系，为筛选高产能细胞提供了快速途径。2.精准插入“有用”基因，稳定生产目标蛋白传统方法中，外源基因随机插入CHO细胞基因组，常导致表达不稳定。而 CRISPR/Cas9 能将目标基因 “定点插入” 到高产区域：只需设计含同源序列的 “修复模板”，就能引导细胞将外源基因整合到指定位置；短至40bp的同源序列即可生效，操作简单，插入效率比传统方法提升数倍。这意味着，科学家能快速构建稳定表达重组蛋白的CHO细胞系，缩短药物研发周期。3.调控基因 “开关”，优化细胞性能除了“剪接”基因，CRISPR/Cas9还能当“基因开关”：将Cas9蛋白改造为“失活Cas9（dCas9）”，它就失去切割能力，但仍能结合目标基因，从而：抑制基因表达（如关闭消耗营养的冗余基因）；激活基因表达（如开启促进蛋白分泌的基因）。这种 “不切割只调控” 的方式，能在不破坏基因组的前提下优化细胞代谢，更安全地提升生产效率。4.全基因组 “筛查”，找到关键基因过去，想知道哪个基因影响CHO细胞产能，需逐个验证；现在，CRISPR/Cas9能一次性筛查全基因组：设计覆盖所有基因的 gRNA 库，导入细胞后，通过筛选高产细胞，再测序分析哪些 gRNA被富集；快速锁定关键基因（如调控细胞增殖、抗凋亡的基因）。这种方法已帮助科学家找到影响抗体产量的新基因，为定向改造提供了精准靶点。四、从 “经验摸索” 到 “精准设计”：CHO 细胞改造的进化史 1.过去：靠 “猜” 和 “筛”早期缺乏基因组信息，只能通过随机突变、过量表达基因等盲目尝试。比如敲除FUT8基因，需筛选12万个细胞才能成功，效率极低。2. 现在：CRISPR/Cas9 成 “主力工具”2014年后，CRISPR/Cas9在 CHO 细胞中 “大显身手”：基因敲除效率从传统方法的 0.1% 提升到 47.3%；能快速构建多基因敲除细胞系，且可定点插入外源基因；结合基因组数据和计算机模型，已能预测哪些基因改造能提升产量。3. 未来：更精准、更高效科学家正在突破现有瓶颈：提升编辑精度：优化 gRNA 设计、改造 Cas9 蛋白，减少 “脱靶” 风险；提高修复效率：通过化学方法同步细胞周期，让 HDR 修复效率提升至 38%；结合 AI 模型：用计算机模拟细胞代谢，提前预测改造效果，减少实验次数。未来，或许能像 “搭积木” 一样设计CHO细胞，按需生产高产量、高质量的生物药。五、对科研和产业的意义 对科研人员来说，CRISPR/Cas9 让 CHO 细胞研究从 “经验驱动” 转向 “理性设计”，能更深入探索基因与产能的关系；对产业而言，它能缩短细胞系开发周期（从数月缩至数周）、降低成本，让生物药更易普及。虽然这项技术目前主要用于生物制药，但它的核心逻辑 ——“精准改造细胞基因以提升性能”，也为其他细胞培养领域（如疫苗生产、细胞农业）提供了借鉴。或许未来，我们能通过类似技术优化养殖相关的细胞培养体系，实现更高效的生物制品生产。CRISPR/Cas9 就像给 CHO 细胞装上了 “基因导航系统”，让生物制药从 “看天吃饭” 变成 “按需定制”。随着技术不断成熟，这个 “细胞工厂” 还将创造更多可能。

摘要杆状病毒是一类具有双链DNA基因组的包膜昆虫特异性病毒。在众多杆状病毒种类中，加州棉铃虫多核多角体病毒(AcMNPV)是研究最为深入的物种。凭借其生物安全性、宿主范围狭窄以及基因组修饰平台多样化的优势，AcMNPV已成为重要的生物技术工具。本文将系统梳理杆状病毒最广泛的技术应用领域。首先概述其在幼虫和细胞培养中的自然生命周期及其应用价值；其次探讨基于杆状病毒的蛋白质表达系统(BEVS)及其在制药与生物技术领域的多重应用，重点聚焦疫苗生产领域—其中许多疫苗已实现商业化或处于研发后期阶段(如诺瓦瓦克斯公司开发的COVID-19疫苗)。此外，重组杆状病毒(如BacMam)还可作为高效的基因转导载体和脊椎动物细胞蛋白表达系统。最后，我们将详细阐述基于杆状病毒的各种基因治疗策略及其在不同疾病中的应用。本研究的主要目标是提供一份全面的最新综述，涵盖杆状病毒在不同生物技术领域的应用，重点介绍各领域中使用的基因修饰策略。关键词杆状病毒；BEVS；BacMam；病毒载体；疫苗；基因治疗1. 介绍杆状病毒表达载体系统(BEVS)自上世纪80年代初问世以来，始终保持着重要地位。最初，这类昆虫特异性病原体因其作为生物害虫防治剂的潜力而备受关注，被视为农业领域替代化学杀虫剂的理想选择。随着科学家利用基因改造的加州棉铃虫多核多角体病毒(AcMNPV)和鳞翅目细胞成功生产出重组人干扰素-β[1]，BEVS在生物技术领域确立了其多功能且强大的工具地位。至今已有数千种蛋白质通过该系统实现表达，其中部分产品甚至已投入商业应用。BEVS技术之所以成为极具吸引力的平台，不仅因其安全性显著优于其他基于哺乳动物细胞培养的病毒载体技术，更得益于其较低的生产成本和最重要的多功能性。正是这种多功能性推动了BEVS技术的指数级发展，也是生物技术公司和研究机构选择它而非传统方案的关键原因。本文将概述BEVS在人类与兽医健康领域的应用，重点解析不同设计方案如何制备免疫原和基因治疗载体(图1)。我们通过PubMed、Scopus、ScienceDirect和GoogleScholar等电子数据库进行了全面文献检索，采用的关键词组合包括：杆状病毒、杆状病毒分子生物学、杆状病毒表达载体、杆状病毒疫苗、杆状病毒等。图1.基于杆状病毒技术的主要应用示意图。使用BioRender.com软件创建(访问日期：2022年11月29日)。2. 自然界中的杆状病毒杆状病毒科的成员属于昆虫纲中的鳞翅目、膜翅目、双翅目、直翅目、鞘翅目、脉翅目、夜蛾目和毛翅目[2]等目，专门感染这些目昆虫的幼虫阶段。这类病毒拥有环状双链DNA基因组，长度约80-180千碱基对，被包裹在形似手杖的杆状核衣壳中。该核衣壳直径约40-50纳米，长度200-400纳米，外层包裹着源自宿主细胞的膜结构。目前，杆状病毒科的分类包括四个属：Alpha baculovirus、Beta baculovirus、Gamma baculovirus和Delta baculovirus。作为杆状病毒家族的重要成员，加州棉铃虫核多角体病毒(AcMNPV)自发现以来便备受关注。尽管其他杆状病毒如家蚕核多角体病毒(BmNPV)及其著名宿主家蚕[3, 4]已展现出生物技术应用价值，但本文重点聚焦于AcMNPV及其在农业领域的具体应用。核衣壳会根据生命周期的不同阶段，被整合到两种不同类型的病毒颗粒中。当病毒脱离宿主后，它们会被包裹在蛋白质基质中形成特有的包涵体(OBs)，这种结构能有效抵御紫外线辐射、脱水等恶劣环境条件的侵害。杆状病毒的生命周期始于易感昆虫取食含有包涵体的叶片材料时，此时由于pH值变化，蛋白质基质会在昆虫中肠内解体，释放出所谓的包涵体衍生病毒(ODVs)。这些病毒通过膜融合机制感染幼虫肠道上皮细胞，从而启动病毒生命周期。被感染的细胞会产生第二种病毒粒子，称为出芽病毒(BV)，它会在昆虫幼虫[2, 5]体内传播感染。基因表达以转录级联的形式进行时间调控，早期阶段的基因产物调控后期阶段的产物生成。(在早期的即时类中)由宿主RNA聚合酶的作用进行转录，而晚期和极晚期基因则需要病毒编码的聚合酶。在感染的后期阶段，病毒后代从产生BV转变为将核衣壳保留在细胞核内，并将包膜和包含体包裹到病毒编码的蛋白(多角体)基质中，以形成多个OB(多角体)，这些OB随后在细胞裂解和昆虫幼虫液化后释放到环境中。杆状病毒自然感染周期的这些固有特性，加上它们狭窄的宿主范围，使它们成为综合虫害管理[6]的重要生物输入工具。3. 芽生病毒和细胞系虽然使用杆状病毒作为生物害虫控制剂利用了OBs，但大多数杆状病毒的生物技术应用利用了BV。BVs是可以在细胞培养中繁殖和使用的形态类型。病毒粒子有包膜，其包膜上有一种III类糖蛋白，称为GP64。GP64负责病毒通过与一种尚未充分表征的细胞受体相互作用而附着并进入宿主细胞。尽管杆状病毒在致病性和复制能力方面宿主范围极为有限，但芽生病毒却能成功侵入多种细胞类型。就昆虫细胞系而言，源自三叶蛾(Trichoplusiani)和谷螟(Spodoptera frugiperda)卵巢的细胞系应用最为广泛。市售常用细胞系包括Sf9、Sf21以及High Five(BTI-Tn-5B1-4)等。虽然昆虫属于真核生物，但其N-糖基化模式与哺乳动物存在显著差异：昆虫产生的N-聚糖末端仅含甘露糖残基，而哺乳动物则通过多种酶促反应形成末端带有唾液酸残基的复杂N-聚糖。根据蛋白质特性，N-糖基化对其功能可能具有决定性作用。基于这一需求，科学家们开发了多种基因工程细胞系，这些细胞不仅能添加N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖和唾液酸等末端修饰基团，还能阻止[7]型N-聚糖中岩藻糖的添加。同理，SweetBac [8]病毒载体搭载杆状病毒基因组，可提供合成哺乳动物样N-聚糖所需的酶系，用于生产表达哺乳动物糖蛋白的重组杆状病毒。PolyBac[9]是另一款经过改造的杆状病毒载体，支持多重转基因插入，已被成功应用于昆虫细胞糖基化途径的定制化改造。目前科研人员已开发出多款搭载不同N-聚糖酶的PolyBac衍生杆状病毒载体，这类载体既能表达目标蛋白，又能携带特定糖基化酶来实现预期的糖基化模式。4. 重组杆状病毒生产BEVS通常需要生成至少一种携带目标基因(GOI)的重组杆状病毒。尽管市面上已有多种重组杆状病毒生产系统，但大多数都基于两种策略之一。第一种策略是在昆虫细胞内进行同源重组：一种是将经过基因改造、能在大肠杆菌(杆状病毒)中复制的杆状病毒基因组(称为杆状病毒)，该基因组携带生成病毒所需的所有遗传信息，但可能因关键基因被截短而无法产生野生型病毒；另一种是将携带目标基因序列(GOI)的转移质粒插入昆虫或杆状病毒启动子下游。这种表达盒(包含启动子、 目标基因和转录终止信号)两侧带有两个区域，可与杆状病毒进行重组。当重组发生时，关键基因得以重建，使携带GOI的 杆状病毒恢复在昆虫细胞中的复制能力。牛津表达技术公司的flash BAC™平台正是采用这一方法。第二种策略则是通过Tn7转座子的位点特异性转位进入杆状病毒。市售的Bac-to-Bac表达系统(英杰公司)正是基于这种方法。简而言之，该系统包含以下组件：携带GOI的转移质粒载体置于特异性启动子下，该启动子两侧带有Tn7转座位点，可使转座酶在大肠杆菌DH10Bac细胞内完成转座。这些细菌细胞同时携带杆状病毒质粒和辅助质粒，后者编码Tn7转座酶。完成细菌细胞内的转座后，需对杆状病毒质粒进行纯化处理，并将其转染至昆虫细胞中，最终获得重组杆状病毒。对于需要携带一个以上目标基因的杆状病毒制备，目前已有现成的系统可供使用。Multi Bac[10]是一种改良型杆状病毒基因组，通过结合Cre介导的质粒融合技术，采用序 列重复扩增与无连接克隆的迭代循环，可实现多个目标基因的插入。近期，纽霍尔德团队[11]开发了基于黄金门技术的单步克隆系统GoldenBac，该系统兼容Tn7转座子和同源重组(HR)杆状病毒载体。与此类似，SmartBac[12]采用多蛋白构建策略，通过重叠PCR与 Gibson组装技术结合Cre-LoxP重组，成功制备出携带多个目标基因的大容量转移质粒。值得注意的是，Jacob等人最近的一份报告[13]研究表明，与基于Tn7的系统相比，用于重组杆状病毒生产的HR系统稳定性更高，这表明HR系统可能更适用于安全生物制品的生产。此外，实验还被用于鉴定最小杆状病毒基因组，并改进表达载体的构建[14, 15]。5. 杆状病毒衍生免疫原用于疫苗开发一般来说，疫苗学中一个好的免疫原应该诱导一种反应，以完全预防或减少病原体感染。免疫原能否产生良好的保护效果，很大程度上取决于其特性。像活体减毒病毒株和细菌这类模拟自然感染的疫苗通常能产生高效免疫，而由多糖制成的亚单位疫苗效果则相对较弱，可能需要更复杂的配方(如添加佐剂)配合使用，并且接种方案往往需要分多次注射并进行加强。因此，合理的免疫原设计至关重要，包括研究功能表位和关键蛋白质等。BEVS系统的多功能性已被广泛用于生产大量和多种免疫原，用于人类和兽医用途。5.1. 重组蛋白在开发亚单位疫苗时，即不携带完整病原体而只携带部分病原体的疫苗，重组蛋白的生产通常是所选择的策略。BEVS为异源蛋白生产提供了一个快速、灵活且成本低廉的平台，这在应对新冠疫情等全球卫生紧急事件时尤为重要。有研究指出，以流感疫苗为例，若采用BEVS替代传统胚胎化鸡蛋培养平台，原本需要六个月才能完成的4.25亿支疫苗生产周期，将缩短至45天即可完成。FluBlok®[17](Protein Sciences Corporation)是四价流感疫苗，通过BEVS生产，表达四种不同甲型和乙型流感病毒毒株的血凝素(HA)蛋白，目前已获得FDA许可用于18岁及以上人群。在临床前研究阶段，Shin团队成功研发出针对寨卡病毒(ZIKV)[18]的重组疫苗候选株。该疫苗基于两种寨卡病毒毒株表达的杆状病毒包膜蛋白构建，其保护效果在妊娠小鼠及其子代中得到验证，证实母体抗体能够传递给胎儿。此外，研究团队还观察到交叉抗体介导的登革热病毒(DENV)中和作用。该系统生产的其他病毒抗原在临床前阶段也展现出良好的免疫原性，例如导致水貂难治性腹泻的水貂圆环病毒衣壳蛋白[19]、细小病毒VP2蛋白[20]，以及来自草饲动物的VP4和VP35蛋白。例如鲤鱼轮状病毒(GCRV)[21]等。需要特别说明的是，上述蛋白质均以野生型形式表达，未进行任何人工修饰。此外，研究人员还开发了携带目标抗原与另一种蛋白质的嵌合体。例如，李及其团队[22]在田间试验中首次证实：由水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)与口蹄疫病毒VP1 GH环表位组成的嵌合体疫苗，在免疫原性方面已超越市售疫苗。该疫苗通过生物等效性验证系统(BEVS)成功制备。除了传统疫苗通过预防接种者患病来实现疾病防控外，科学家还研发出其他类型的疫苗。其中，疟疾传播阻断疫苗(TBVs)作为关键辅助手段，在加速消除疟疾方面发挥着重要作用。这类疫苗能诱导人体产生抗体，阻止疟原虫的有性繁殖阶段进入蚊子中肠，从而阻断人蚊传播链。近期，两项关于基于生物工程病毒载体(BEVS)生产的重组TBV候选疫苗的研究成果已正式发表。李等人[23]研究表明，Pfs48/45 6C蛋白片段在贝氏疟原虫(BEVS)中表达时无需融合伴侣即可发挥作用。通过抑制N-糖基化修饰，该蛋白仍保持生物活性并展现出显著的阻断传播效果。另一项由奎及其团队完成的研究显示，贝氏疟原虫中表达的间日疟原虫HAP2蛋白具有阻断传播活性，研究者首次将其列为新型TBV候选[24]。针对白喉、破伤风等细菌性疾病，疫苗的研发重点在于靶向作用于致病毒素。类毒素疫苗属于严格意义上的亚单位疫苗，通常由化学灭活的毒素或经过灭活处理的重组毒素构成。以杆状病毒表达类毒素为例，其成功案例包括生产出无毒的产气荚膜梭菌[25]C末端CPA毒素。自COVID-19大流行开始以来，严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)免疫原的开发一直是许多制药公司、政府机构和研究实验室共同关注的焦点。尽管昆虫细胞生产的免疫原已处于研发后期，但首批在紧急使用授权下获批的疫苗仍采用其他生产系统。不过诺瓦瓦克斯公司研发的COVID-19疫苗(现以Nuvaxovid和Covovax品牌上市)成为首个获得FDA批准的生物等效疫苗(BEVS)，也是第五款获批的同类产品。该疫苗被生产商称为纳米颗粒疫苗，实则属于亚单位疫苗。其核心成分是经过改造的刺突蛋白，通过将脯氨酸取代原有残基(K986P和V987P)来维持糖蛋白的融合前构象，并增强其抗蛋白酶切割能力[26]。在Sf9细胞中生产的蛋白质被整合到细胞膜后，与M-Matrix佐剂共同组装成脂质纳米颗粒。数据显示，该疫苗采用两剂接种方案时总有效率达90.4%，对预防中重度疾病[26]的保护率更是高达100%。5.2. 类病毒颗粒在前一节中，我们讨论了亚单位免疫原。尽管它们比减毒活疫苗更安全，但往往需要更高剂量或加强剂才能激发有效免疫应答。病毒类免疫原的一个极具吸引力的替代方案是病毒样颗粒(VLPs)。这类自组装纳米结构既能模拟有包膜病毒粒子，也能模仿无包膜病毒的衣壳。其组成可包含单个或多个病毒蛋白，既有全长蛋白也有截短蛋白，既有野生型也有基因工程改造的版本。与病毒粒子不同，VLPs不具备复制能力——虽然可能含有部分遗传物质，但既无法自我复制，也不会恢复致病基因型。基于此类结构的疫苗融合了减毒病毒粒子和亚单位疫苗的优势：纳米级尺寸、自佐剂特性以及表位多拷贝分布的特点，都能被免疫系统精准识别并有效激活。杆状病毒与昆虫细胞已被广泛用于病毒样颗粒(VLPs)的制备，采用多种技术手段。最基础的方法是用携带野生型免疫原的重组杆状病毒感染易感昆虫细胞，该免疫原可自组装形成VLPs。根据蛋白质特性不同，VLPs可通过两种途径获取：包膜型VLPs直接从细胞膜出芽，可从上清液中提取；衣壳型VLPs则需通过细胞裂解液获取。典型案例包括：源自HIV gp140(gp120及gp41胞外结构域)[27]、嵌合型诺如病毒VP1[28]与野生型诺如病毒VP1[29]、牛乳头瘤病毒9型(BPV9)L1 [30]、柯萨奇病毒B4 VP1[31]等VLPs。所有这些VLPs在临床前研究中均显示出良好的免疫原性。更复杂的病毒样颗粒，即携带多种蛋白质的病毒样颗粒，也可以通过重组杆状病毒感染敏感细胞或幼虫来产生。针对这一设计方案，我们可选择两种替代方案：一是让多种杆状病毒共同感染宿主细胞，每种病毒仅携带一个外源蛋白基因；二是采用单一杆状病毒感染策略，通过不同启动子调控目标基因表达。采用后一种方法时，伯纳迪诺团队[32]成功制备出携带包膜蛋白(RVGP)和基质蛋白(RVM)的狂犬病病毒样颗粒。同理，张等人[33] 研究人员成功制备出含有VP1和VP3衣壳蛋白的柯萨奇病毒B5(CVB5)病毒样颗粒(VLPs)。这些VLPs不仅完美复刻了CVB5病毒粒子的外形与尺寸，其引发的免疫反应也更为显著——通过检测总IgG水平和中和抗体水平发现，相较于灭活疫苗在小鼠感染致病性CVB5毒株时产生的保护效果，这种新型疫苗能激发更强的免疫应答。虽然联合感染策略能够产生复杂的VLP，但需要优化感染倍数(MOI)，以确定最佳组合，从而将目标抗原以适当的化学计量结合到VLP中，这并不总是直接的。不过，当只需要一种重组杆状病毒时，某些多蛋白病毒样颗粒(VLPs)的制备会更加便捷。例如，源自编码可自我切割多蛋白的病毒的VLPs就属于这种情况。目前这类多蛋白VLPs已在昆虫细胞中成功制备，包括登革热病毒[34]和肠道病毒71 [35]等多种病毒株。这两种策略的缺点在于，病毒样颗粒(VLPs)需要从已出芽的杆状病毒(BVs)中进行纯化分离。虽然BVs本身可作为佐剂促进T细胞CD8 +免疫应答，但树突状细胞成熟后会分泌促炎性细胞因子[36, 37]。由于部分制剂需避免这些成分的存在，这就需要额外增加纯化步骤。作为感染介导策略的替代方案，可开发稳定转化的重组昆虫细胞系。目前市面上已有现成载体可供使用，例如pIB/V5-His及其变体(赛默飞世尔科技公司)，当然也可以自行构建载体。这种替代方案不含BV病毒，且便于纯化——这对于包膜病毒样颗粒(VLPs)而言尤为重要。例如，Khanefard及其同事[38]成功地生成了一种转基因Sf9细胞系，该细胞系以组成性方式产生H5N1流感神经氨酸酶VLPs，并具有免疫原性。市售的病毒样颗粒(VLP)疫苗已问世多年(首个重组蛋白乙肝疫苗于1986年获批)[39]，但唯一采用昆虫细胞生产并获准用于人体的疫苗仍是葛兰素史克公司的Cervarix®。该疫苗可预防多种人乳头瘤病毒(包括HPV16和HPV18)，其核心成分是源自HPV16型和18型L1蛋白——这两种病毒类型导致了全球70%的宫颈癌病例。新一代基于VLP的HPV疫苗通过同时表达L1和L2蛋白或L1-L2嵌合体，展现出更广谱的保护效力。目前针对其他病原体的多款VLP疫苗已进入临床试验的高级阶段。值得一提的是，基于VLP技术的抗SARS-CoV-2疫苗也正处于不同研发阶段[43]。虽然VLPs是一个非常有吸引力的平台，用于生产新一代免疫原，因为它们结合了灭活疫苗和亚单位疫苗的优点，由于通常需要对VLP进行杂质共纯化，因此纯化过程可能比较繁琐，这增加了下游处理成本。5.3. 杆状病毒表面和衣壳显示在病毒表面展示感兴趣的蛋白质有多种应用，从确定蛋白质相互作用到诊断工具以及免疫原。杆状病毒作为展示载体很有趣，因为与其他病毒载体不同，在人类和其他脊椎动物中没有预先存在的免疫力。在病毒出芽表面展示目标蛋白的技术(即表面展示技术)可通过多种策略实现，这些策略涉及将目标蛋白或特定肽段与GP64蛋白及其部分结构进行嵌合融合。当蛋白质与完整GP64融合时，会形成兼具膜运输信号、成熟过程及整合到出芽病毒所需全部功能的嵌合蛋白。通过该技术，科学家已成功展示出HIV-[44]的GP120和弓形虫[45]的ROP4等大型蛋白。另一种可能的组合方式是将蛋白质与GP64的信号肽(SP)、跨膜区(TM)及胞质结构域(CTD)融合，其中GP64的胞外结构域被目标蛋白替代。例如，薛教授团队成功展示了水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白E[46]，该展示在小鼠体内引发了强烈的免疫反应。此外，猪圆环病毒2型(PCV2)Cap(d41)蛋白的展示在小鼠和猪体内均能诱导免疫应答[47]。采用相同策略，罗教授团队[48]构建了寨卡病毒(ZIKV)E蛋白的嵌合体，该蛋白通过脂质体表面展示，在小鼠模型中展现出对寨卡病毒的保护作用。尽管目前更常见的是将膜蛋白胞外结构域与GP64的跨膜区融合展示，但也可保留目标蛋白的野生型跨膜区，同时将其与GP64的信号肽和胞质结构域进行双重融合。然而，在某些情况下，该蛋白可以不与GP64融合而被整合到包膜中，如流感病毒的血凝素(HA)[49]或水泡性口炎病毒(VSV)的G蛋白[50, 51]。需要强调的是，重组杆状病毒仍保留GP64的野生型拷贝，该拷贝将与嵌合体一起整合到包膜中。虽然杆状病毒表面展示技术能够引发体液免疫应答，但其诱导T细胞CD8+型细胞应答的效果并不理想[52, 53]——这类免疫反应对清除胞内病原体至关重要。不过，出芽病毒在另一种抗原展示方式(衣壳展示)中却能大显身手。由于翻译后的蛋白质经过加工处理后可通过MHC-I途径呈递，这种展示方式更有利于激发此类免疫应答。衣壳展示技术利用杆状病毒能够侵入多种不同细胞的特性，其核心在于将目标蛋白整合到病毒衣壳中。该原理与表面展示类似，具体过程是将目标蛋白或肽段与主要衣壳蛋白VP39 [54]融合。结果表明，将OVA(卵清蛋白)与VP39融合后，专业呈递细胞可呈现抗原MHC-I，并诱导细胞毒性免疫应答[52, 55]，且该策略显著降低了引发强烈免疫应答所需的抗原量。6. 杆状病毒进入哺乳动物细胞：转导如前所述，尽管AcMNPV病毒无法在脊椎动物体内复制，但它能够进入哺乳动物细胞，并通过哺乳动物启动子表达异源基因，这一过程被称为基因转导。杆状病毒的转导能力已被用于诱导特异性免疫应答[56]，近年来更被应用于开发多种基因治疗策略。然而，AcMNPV病毒进入哺乳动物细胞的具体机制仍不明确。最初有研究认为其通过静电作用实现入侵。病毒与细胞膜的相互作用在病毒入侵过程中起着关键作用[57]。研究表明，杆状病毒通过与细胞膜上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(尤其是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)结合，实现对哺乳动物细胞的感染和转导[58]。基于GP64糖蛋白介导的膜融合机制及杆状病毒进入昆虫细胞的途径，研究者提出：在哺乳动物细胞中，依赖网格蛋白介导的内吞作用(不依赖低pH环境)是主要入侵机制。此外，观察发现病毒在早期内体中的融合过程，可能是影响高效转导的主要障碍[59]。值得注意的是，有报道称小窝结构可能参与杆状病毒的入侵——在BHK21细胞系中，使用干扰小窝体形成的抑制剂染料木黄酮时，转导效率显著提升[60]。另一方面，一些结果表明，杆状病毒可以通过不同于网格蛋白介导的内吞作用或巨胞饮作用的机制进入某些哺乳动物细胞系，如肝细胞，这表明吞噬作用也可能参与其中[61]。尽管AcMNPV的病毒进入机制似乎存在细胞类型依赖性差异且需进一步研究，但GP64糖蛋白在介导病毒入侵中的关键作用已十分明确[62]。GP64对杆状病毒侵入哺乳动物和昆虫细胞时的病毒附着、内化及内体膜融合过程至关重要[63]。AcMNPV的附着始于GP64与细胞表面分子的相互作用，随后内体内部的pH值变化会触发该糖蛋白的构象改变。病毒进入细胞后，会被转运至内体，核衣壳释放到细胞质中，并通过肌动蛋白驱动的运动机制被立即引导至细胞核，从而实现核孔复合体的跨膜转运[64]。在细胞核中，病毒DNA被宿主机制识别和转录；在此阶段观察到细胞染色质分布的改变[65]。提高杆状病毒转导效率的策略尽管杆状病毒能够进入多种类型的细胞，但这一过程并不总是高效。近年来，研究人员开发了多种策略来提高杆状病毒的转导效率。其中一些方法涉及使用聚乙烯亚胺(PEI)或聚乙二醇(PEG)[66, 67]等化学试剂，通过修饰病毒与细胞膜之间的静电相互作用。另一种方法是利用其他病毒的融合蛋白对杆状病毒进行假型化改造。此外，有报道称，使用水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白进行假型化的病毒，其转导哺乳动物细胞的效率比未进行 假型化的病毒更高(图2B)。有趣的是，在低转导复数条件下使用截短版VSV-G而非全长版本时，转导效率并未得到提升[68]。此外，其他蛋白质也被用于杆状病毒的假型，包括甲型流感病毒神经氨酸酶[69]或Thogotovirus[70]的糖蛋白。VSV-G病毒还被融合到杆状病毒表面的肿瘤配体(LyP-1、F3和CGKRK)上，使肿瘤结合能力和特异性转基因表达效率提升了2至5倍[71]。另一种提高转导效率的策略是开发携带亲和素的杆状病毒。这种表面修饰显著增加了病毒进入细胞的能力，从而大幅提升了基因递送效果[72]。不过，提升转导效率的手段不仅限于病毒蛋白。研究团队还在杆状病毒包膜中添加了三种疟疾环孢子虫蛋白变体，成功增强了其在肝细胞中的转导效率[73]。但需要指出的是，转导效率不仅取决于病毒进入细胞的能力，更与基因表达的整体水平密切相关。为提高杆状病毒转导效率，研究人员采取了一种通过抑制抗病毒反应相关基因来增强基因表达的策略。王等人报告称，敲低受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)——该蛋白在免疫应答和细胞死亡调控中起重要作用——可导致不同人类细胞系中杆状病毒介导的转基因表达增加(图2D)，且不影响细胞活力或病毒进入[74]。图2.通过使用产生复制性附加体的载体(A)、表面展示GP64或VSV-G嵌合体的多拷贝版本(B)、补体抑制剂表面展示(C)以及靶向抗病毒应答通路的shRNA表达(D)来提高转导效率。改编自BioRender.com所著《病毒入侵者检测》和《补体通路》(访问日期：2022年11月29日)。数据来源于https://app.biorender.com/biorender-templates.7. 基因疗法基因疗法是一套具有高度灵活性的治疗策略，因其能根据个体差异进行个性化调整，可应用于包括癌症在内的多种疾病治疗。基因治疗载体主要分为两大类：非病毒型和病毒型。载体。非病毒载体主要由共轭多阳离子聚合物构成，这类物质能够实现DNA的递送。带正电荷的脂质体就是这类载体的典型代表。虽然这类载体在生物安全方面具有优势，但其应用受限于转基因递送和表达效率较低[75]。另一方面，病毒载体如杆状病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒及腺相关病毒(AAV)等，在细胞进入和转导不同基因时效率更高。具体优缺点取决于不同病毒载体的特性[76]。目前，AAV载体、慢病毒和逆转录病毒已成功应用于临床，共有19种获得FDA批准的基因治疗产品[77]。然而，慢病毒和逆转录病毒载体的克隆能力较低，并且有可能因整合到宿主基因组中而发生突变。此外，在开发具有复制能力的逆转录病毒时还存在潜在的安全性问题[78]。当前病毒载体的高生产成本、低可扩展性和潜在的生物安全问题突显了使用杆状病毒进行基因治疗的巨大潜力[79, 80]。杆状病毒基因递送系统凭借其多功能性和低毒性，不仅能够实现精准给药，还能设计克隆大型复杂治疗性基因，有效降低副作用并提升疗效[81]。该基因治疗系统易于改良，有望成为靶向基因治疗的重要工具。杆状病毒(BV表型)已在癌症治疗、疫苗研发和再生医学等多个领域成功应用，充分展现了其广泛适用性[81-84]。与其他常见病毒载体相比，杆状病毒具有多项优势。首先，杆状病毒介导的转导不会对哺乳动物细胞产生毒性作用，即使在高MOI [85, 86]条件下也不会干扰细胞生长。此外，杆状病毒不会在被转导的哺乳动物细胞中复制[79]。杆状病毒的这些特征尤为重要，因为其他病毒载体是人类病原体或整合到宿主基因组中，因此具有生物学风险。杆状病毒作为基因治疗载体的另一大优势在于其强大的克隆能力。杆状病毒(Ac-MNPV)基因组是一个130 kb的环状双链DNA分子，最大克隆容量至少可达38 kb。相较于逆转录病毒和AAV载体[87]的有限克隆能力，这种灵活性显得尤为突出。与其他病毒载体相比，杆状病毒的生产更为便捷。逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒(AAV)载体需要将携带必需基因的质粒转染至包装细胞才能完成生产。而杆状病毒则不同，只需通过悬浮培养或单层培养感染昆虫细胞，感染后3-4天即可收集上清液进行扩增。更值得一提的是，从构建、扩增到操作的整个流程，完全可以在生物安全等级1(BSL-1)实验室中完成，无需任何特殊设备。但是，根据基因组中所含转基因的性质，可能需要高于BSL-2的生物安全等级。最后，一个最重要的优势在于哺乳动物对杆状病毒不存在先天免疫。相比之下，其他病毒载体最常见的问题之一是：大多数人一生中都会接触这些病毒并产生特异性体液免疫应答。此时，体内循环的抗体会显著降低病毒载体转导效率[87]。然而，杆状病毒作为基因治疗载体也存在明显缺陷。其主要缺点在于只能在哺乳动物细胞中诱导短暂的转基因表达。在体内环境中，转基因表达水平通常会在第7天开始下降，并于第14至21天[81, 88]完全消失。此外，与逆转录病毒、慢病毒及腺相关病毒(AAV)载体相比，使用杆状病毒进行体外转基因表达的持续时间显著缩短。杆状病毒载体与其他病毒载体的不同之处在于，其携带的基因在宿主细胞核中可以持续存在的时间。逆转录病毒、慢病毒和腺病毒载体的DNA可以以整合或游离的形式在细胞核中长期存在。相比之下，Tjia等人证明杆状病毒DNA在转导哺乳动物细胞的细胞核中仅存留24-48小时[76]。使用杆状病毒作为基因治疗载体的另一个缺点是补体介导的灭活效应。当杆状病毒与血清补体接触时，会迅速导致病毒失活。为减少补体对杆状病毒转导的负面影响，需要进行多项改良。但需注意的是，补体系统并非杆状病毒独有的难题——它同样构成了脂质体、小鼠逆转录病毒及各类合成DNA复合物[87, 89]等其他基因递送系统的体内应用障碍。此外，杆状病毒与其他包膜病毒类似，具有极强的脆弱性。其包膜结构对病毒的感染能力和转导能力至关重要——这主要归功于锚定在包膜上的GP64蛋白，该蛋白负责促进病毒与细胞膜的融合[90]。正因如此，病毒极易受到机械剪切力的影响，导致稳定性相对较低。这种普遍存在的问题在其他包膜病毒中同样存在，例如逆转录病毒。超速离心法常用于杆状病毒的纯化，但也会导致感染性显著降低，这可能是由于病毒包膜受损所致。其热稳定性较差，加上存在被血清补体灭活的风险，可能进一步限制杆状病毒基因传递载体[76, 91]在体内的应用。7.1. 杆状病毒基因传递载体随着杆状病毒转导哺乳动物细胞能力的发现，其治疗应用迅速扩展。此后，研究人员对病毒基因组进行改造和调控，以提高转导效率并简化生产流程。由此开发出多种载体系统，包括BacMam、Bac-to-Bac、Multi Bac以及这些AcMNPV转移载体的衍生物[92-95]。要使外源基因正确表达，必须选择病毒或哺乳动物启动子，并被转导细胞的转录机制所识别。由于病毒p10和多角体蛋白启动子具有较高的表达活性，因此在昆虫细胞中被最频繁地用于促进转录。然而，哺乳动物启动子也可用于病毒转导后驱动异质性基因表达。这类系统通常称为BacMam[93]。BacMam系统中使用的某些哺乳动物启动子包括巨细胞病毒(CMV)、猴病毒40(SV40)、鸡β-肌动蛋白(CAG)和乙肝病毒(HBV)等基因启动子[96]。病毒和哺乳动物启动子可以与基因组增强子结合，以促进转基因的转录。具体来说，将额外的同源区域1(hr1)插入杆状病毒中已被用于激活哺乳动物启动子，并提高了转基因的稳定性，延长了转基因的过表达时间[97]。启动子的选择还需根据目标基因的特性(蛋白质、长链非编码RNA、短发夹RNA、基因调控RNA)来确定。本文将重点解析杆状病毒载体的设计原理，具体分析不同治疗基因(GOI)的特性如何影响载体设计，并着重探讨在个性化治疗中优化其应用的多种策略。7.2. 蛋白质表达目前应用最广泛的杆状病毒基因治疗策略是表达一种或多种具有特定生物学活性的蛋白质，这种生物学功能可作为治疗一种或多种疾病的效应因子。在基因治疗的众多靶向疾病中，癌症是最受关注的领域之一。以杆状病毒为基础的抗癌蛋白表达技术为例：鸡传染性贫血病毒凋亡素可对抗肝癌[98]；单纯疱疹病毒胸苷激酶能抑制胶质母细胞瘤[99]；抗血管生成融合蛋白则用于治疗前列腺癌和卵巢癌[100]；此外还有CD40配体等其他应用。膀胱肿瘤中的IL-15[101]和下咽癌中的碘化钠同向转运体表达[102, 103]。基于杆状病毒的蛋白质表达技术也被应用于其他疾病的治疗，例如肝性脑病[104]和心血管疾病[105-112]。此外，该策略还被用于再生医学和组织工程学[113-118]。7.3. shRNA和ncRNA表达除了蛋白质的表达，另一种治疗策略是表达具有预期生物学功能的非编码RNA。通过杆状病毒转导不同细胞系并表达shRNA(短发夹RNA)，可有效抑制目标mRNA [119]的表达。此外，该技术还可用于介导RNA干扰(RNAi)。研究显示，编码 RNAi序列的重组杆状病毒在体外培养细胞中使靶基因表达量降低95%，在大鼠脑组织活体实验中则达到82%的抑制效果[87, 120]。最近，Gottardo和Pidre等人通过shRNA表达开发了一种靶向线粒体肽Humanin及其大鼠同源物Rattin的重组杆状病毒。敲低Humanin表达可诱导体外和体内垂体肿瘤细胞，并在小鼠模型中显著抑制肿瘤进展[121]。同一recBV在卵巢癌细胞中也表现出类似效果[122]。此外，Chen等人构建了含有睡眠美人转座子的杆状病毒杂交系统，该转座子表达长链非编码RNA(LncRNA)PTENP1，用于治疗小鼠模型中的肝细胞癌[123]。李等人提出了一种创新策略，开发出双杆状病毒系统：其中一种病毒携带由loxP位点包围的miR-214靶序列，另一种则编码Cre重组酶。通过在脂肪源性干细胞(ASC)中进行共转导，成功培育出miR-124海绵。实验结果显示，miR-214水平显著降低，ASC细胞的骨再生能力得到[124, 125]倍提升。7.4. CRISPR/Cas系统随着CRISPR/Cas技术的出现，杆状病毒递送系统得到了升级，不仅可以用于基因编辑，还可以用于表观遗传调控和RNA靶向。欣德里克森等人研究人员开发了一种基于Tn7转座子的重组系统，该系统通过携带sgRNA和sgCas9的转移载体实现基因编辑。实验表明，这种重组杆状病毒能在多种哺乳动物细胞中精准编辑目标基因[126]。近期，奥利西诺团队对基于DNA组装技术的Mult-iMate系统进行优化升级，不仅简化了载体构建流程，还优化了杆状病毒(BV)的生产效率，并成功实现了不依赖同源序列的靶向整合(HITI)，在spCas9酶激活后完成精准基因插入[127]。关于疾病基因治疗，使用杆状病毒传递的CRISPR/Cas系统在动物模型中治疗神经损伤[128]和调节血清胆固醇水平[129]。另一方面，这些类型的工具已被用于昆虫系统中，以高效编辑鳞翅目昆虫的基因组[130]以及编辑杆状病毒的基因组，以提高其生物杀虫剂的能力[131]。7.5.在BEVS中生产的recAAVAAV是一种小型无包膜二十面体负链单股DNA病毒(细小病毒科)。由于其结构简单、具有细胞趋向性，且能长期转导表达转基因的非分裂细胞，基于AAV的病毒载体已被广泛应用于基因治疗[132-134]。最初，重组腺相关病毒(rAAV)的制备方法是通过将携带治疗序列和干扰序列(ITRs)的质粒，以及含有AAV基因和其他病毒(通常是腺病毒基因)必要片段的辅助质粒转染至哺乳动物细胞系。然而这种方法无法达到人类治疗所需的产量[135]。这些局限性促使研究者开始评估重组腺相关病毒的生产效率。补体系统[136]。BEVS正是通过这种方式实现的。首先，我们采用了三种重组杆状病毒(两种独立杆状病毒携带rep和cap基因，第三种则使用ITR-GOIITR构建体：即所谓的ThreeBac系统，Glybera®)[137]。随后，我们进行了多项优化改进，包括减少重组杆状病毒的数量[138-141]。所有这些贡献使杆状病毒-昆虫细胞生产平台成为AAV基因治疗产业的理想替代方案。8. 提高杆状病毒在基因传递中的转导效率杆状病毒转导效率受多种因素影响，包括细胞类型、包膜糖蛋白、细胞染色质状态及启动子类型等。鉴于我们已讨论过提升病毒进入的策略，接下来将重点探讨异源构建设计中其他有助于改善和增强转基因表达稳定性的关键要素。8.1. 启动子选择杆状病毒基因传递系统中使用的启动子可决定基因治疗中转导的效率。在昆虫细胞表达系统中最常用的病毒启动子包括多角体蛋白和p10。若将异源蛋白的编码序列与gp64蛋白N端区域的对应序列融合，即可将其整合到病毒包膜中并递送至靶细胞。其他常用的病毒启动子包括p6.9、病毒vp39启动子以及即刻早期基因(IE1)启动子，这些启动子在病毒早期阶段[142, 143]具有较高的表达水平。然而，若要让治疗性基因在哺乳动物细胞中成功表达，就必须选择能被细胞转录机制精准识别的启动子。为此，研究人员已将人类巨细胞病毒、泛素C、磷酸甘油酸激酶以及延伸因子-1α(EF1α)的不同启动子整合到各类杆状病毒载体系统中[144]。启动子的转录效率很大程度上取决于细胞类型及其生理状态。此外，通过将启动子与转录增强子结合使用，可显著提升转基因的表达水平[145]。值得注意的是，启动子的表达步骤本身也会对基因表达产生影响。病毒和哺乳动物启动子的多种组合使杆状病毒基因传递系统成为一种具有极高通用性和定制能力的替代方案[81, 96]。8.2. 杆状病毒GOI在体内和体外的表达扩展如前所述，尽管重组杆状病毒具有诸多优势，但其体内转基因表达窗口期相对较短，最长仅21天[146]。这可能是因为杆状病毒会同时激活经典途径和补体替代途径，导致病毒失活[147]。为防止补体激活并延长基因表达，研究者已采用多种方法。通过在病毒包膜表面表达衰变加速因子(DAF)、类H因子1蛋白及C4结合蛋白等物质，可有效阻断这两种补体通路的激活[148, 149]。河合等人发现，将CD46和CD59蛋白与DAF融合后，病毒颗粒能获得抗补体保护(图2C)[150]。通过上述方法抑制补体激活，可显著延长体内基因表达时间。虽然短时间的基因表达对伤口修复是有用的，但其他类型的治疗，如癌症治疗可能需要更长时间的基因表达。在杆状病毒包膜中添加GP64以外的其他糖蛋白可以延长体内表达的时间窗口。将水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白插入后，DBA/2J小鼠的基因表达时间延长至178天，BALC/c小鼠则为35天[151, 152]。Sung等人证明，通过两种不同的杆状病毒载体(一种编码重组酶，另一种编码目标基因两侧由重组酶特异性重组位点所包围)的非复制表达外显子，在两种载体种均会增加，与转基因表达持续时间[153]相同。此外，研究团队采用相同策略构建了可维持长达48天[154]的复制性游离体。该策略的核心在于：通过一个载体编码Cre重组酶，该酶会切割另一个载体的部分基因组，从而形成包含治疗基因、oriP复制起点序列以及EBV EBNA1蛋白编码序列的游离体。这种游离体能够识别该复制起点并促进病毒复制(图2A)[153-155]。9. 结束语杆状病毒，尤其是AcMNPV，在多种生物技术应用领域已得到广泛研究和应用多年。这些基于杆状病毒的新技术开发工作，不仅在农业领域，还在动物和人类健康等多个领域产生了不同产品和概念验证[81, 96, 134]。通过基因工程技术改造AcMNPV病毒以生成改良型病毒颗粒，这一方法已在基础研究和应用领域得到广泛应用。最初的研究基于昆虫细胞培养中的同源重组技术，但随着AcMNPV杆状病毒载体的问世，细菌基因组修饰技术也得以实现[96]。此外，针对Ac-MNPV基因改造还开发了创新策略，包括构建人工合成基因组[156, 157]以及运用CRISPR/Cas技术进行基因编辑[127, 131]。由于杆状病毒的多功能性，它们不仅可以作为生物杀虫剂使用，还可以作为重组蛋白和纳米结构(如VLPs)表达的载体，用于生成蛋白质展示平台，并作为基因传递载体转导哺乳动物细胞[134]。首批通过BEVS技术开发并投入市场的商业产品包括：针对人类健康的Cervarix®(人源病毒样颗粒疫苗，葛兰素史克公司，2007年)；用于前列腺癌免疫治疗的Provenge®重组蛋白(丹德龙公司，2010年)；抗流感的人源亚单位疫苗Flublok®(蛋白质科学公司，2013年)；以及基于BEVS生产的recAAV载体开发的脂蛋白脂肪酶缺 乏症基因治疗产品Glybera®([134, 158])。另一方面，BEVS生产的多款兽用产品已上市(见表1)。在COVID-19领域，诺瓦瓦克斯公司(Novavax Inc.)推出的Nuvaxovid和Covovax疫苗，是首款获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准的BEVS新冠疫苗[159]。表1.基于BEVS的健康相关产品一览表。相同的产品 ，但根据地理区域的不同而以不同的名称获得许可。近年来，多种基于病毒的产品已获准用于人类临床，既包括基因治疗领域，也涵盖疫苗制剂[160]。与此同时，杆状病毒的基础研究与应用研究呈现爆发式增长，不仅深化了学界认知，更为病毒改造与应用提供了更优策略。 因此可以预见，在未来几年内，各类基于杆状病毒的技术很可能突破临床试验阶段，正式进入商业化进程。杆状病毒的广泛用途及其无可争议的实用性，使其成为人类和动物健康的强大工具。从农业到制药行业的多个应用领域意味着，“魔杖”不再只是一个文字游戏，而是对其巨大技术潜力的真实引用，这得益于病毒粒子的独特形状。

导读：东汉末年，杰出的医学家张仲景所著的《伤寒杂病论》成书后，由于战乱而失散，后经晋代王叔和整理、编次，至宋代成为《伤寒论》和《金匮要略》两书。两书使《黄帝内经》的基本理论和临床实践更具体地结合起来，奠定了我国的临床医学理论，即“辨证论治”的基础。这为后世中医药学的发展开辟了广阔的道路，成了后世医者必读的重要著作，并被列为中医学经典著作。【正文】笔者根据《伤寒论》和《金匮要略》两书对辨证论治、组方用药的具体运用，结合后世的药物学、方剂学理论和临床实践经验及现代药理研究，采用对照、比较、推理、归纳、综合分析的方法，研究其对药组合的规律、法则、原理和应用，以便帮助同道进一步学习张仲景的理法方药，更好地继承和发展中医学。现将其对药配伍规律和法则阐述如下。1、同类药物相配伍，提高药物原有功效。针对疾病发生的主要原因施治张仲景的这种配伍方法应用甚广，但是这种方法并不是任意两种或两种以上同类药物的机械拼凑，而是根据疾病的病位、病性、病势、病程，结合药物的性味、归经、功能，有选择地通过一定的配伍而相互促进，取长补短，从而达到适合病情、增强疗效的作用。需要引起注意的是，通过这种合理的配伍所组成的对药，绝不是药物原有功效的机械相加，而是发挥了两药各自所不能达到的药物功效。这类对药的组合基础，一般有以下三个方面。(1)以性味相同为基础：依据药物的寒、热、温、凉、酸、苦、甘、辛、咸及涩、淡等性味加以组合，是提高药物功效的途径之一。如黄芩、黄连两药均味苦，性寒，相伍之后，清热泻火以解毒，清热燥湿以止痢，清热凉血以止血；人参、白术两药均味甘、苦，性温，相伍之后补脾益气生津；干姜、附子两药均味辛，性热，相伍之后回阳救逆，温中祛寒，温经止痛。此类对药相伍的关系，均属于药物配伍中的相须关系。组合的结果，临床疗效比较明显和突出。(2)以归经相同为基础：“归经”是金代张元素提出的。他在《珍珠囊》一书中，几乎对每味药都注有“归某经”字样。他认为，药物各归其经，则力专而效灵。所以，从归经的角度认识探讨张仲景的药物组合规律，是了解其对药组合规律的主要途径之一。如紫菀、款冬花同归肺经，润肺化痰，止咳平喘；水蛭、虻虫同归肝经，活血化瘀，消癥破结；芫花、甘遂、大戟同归肺、脾、肾三经，攻逐水饮等。(3)以功能相似为基础：功能相似为基础亦是张仲景配伍的主要依据。如麻黄、桂枝均是解表之品，两者相伍，相须为用。麻黄重在宣肺气，开腠理，透毛窍；桂枝重在强壮心阳，温通经脉，解肌发汗。麻黄得桂枝之佐，发汗之力倍增。若单用麻黄则发汗力弱，单用桂枝则无发汗之功。大黄、芒硝均是清热泻火、攻积导滞之良药。大黄直降下行，攻积导滞通便；芒硝润燥软坚，能使坚硬之便变软。两药配合，互相促进，从而使泻火导滞通便功能大为增强。2、异类药物相配伍，治疗阴阳、气血、升降、开合失调和寒热、虚实相兼证。中医学把人体看成一个以脏腑为核心的有机整体，把人体和自然界一切事物都看成是阴阳对立的两个方面，因此，虽然疾病的发生、发展错综复杂，千变万化，但就其病理过程来讲，总不外乎阴阳失调、邪正消长、升降失常三个方面。阴阳失调是体内阴阳、气血、营卫等失调的总称，是一切疾病发生、发展的根本原因。邪正消长也就是邪正斗争的过程，它决定着疾病的发展、变化与转归；升降出入是人体气化功能的基本形式，亦可说是机体进行新陈代谢，维持生命活动的基本过程。这三个方面互相联系，互相影响，但在疾病的发展过程中，总是以一种病理变化为主，其他则处于次要地位。张仲景在组药过程中，根据疾病的病理变化，应用性味、归经、功能完全不同的药物相配伍进行治疗，其大体可以分为以下四个方面。(1)表里、上下药物相配伍，治疗表里同病、上下同病：疾病在发生发展过程中，经常可见两个不同部位同时发生病变。常见的是表病及里、表里同病、里病及表和上下同病。此时，常需应用两个部位同治的法则。如风寒束表，肺胃郁热的证候，则需要以麻黄和石膏相伍。麻黄发汗解表散寒，使表邪尽散；石膏清热泻火，使肺胃郁热得清。“伤寒，医以丸药大下之，身热不去，微烦者，栀子干姜汤主之。”证为胸膈有热，腹中有寒，用栀子苦寒清胸中之热，干姜辛热温肠胃之寒，共使阴阳得和，上下病消。(2)寒热、补泻药物相配伍，治疗寒热夹杂、虚实相兼证：寒热夹杂、虚实相兼是临床常见证候，常需采用寒热并用、攻补兼施的方法治疗。如“伤寒，胸中有热，胃中有邪气，腹中痛，欲呕吐者，黄连汤主之”。证为胸中郁热，胃中有寒，张仲景则以黄连清热，干姜祛寒，同时以人参、甘草、大枣扶正，共使寒热去，正气复，阴阳和，升降顺，诸症解。(3)升降、开合药物相配伍，治疗升降失常，开合失宜所致的病变：升降、开合是脏腑功能活动的表现。在脏腑升降、开合功能失调的情况下，则应采用调和的治疗法则，升降药并用、开合药并用的配伍方法，使其升降、开合各有所治，均得其常。如四逆散中，柴胡和枳实相伍，柴胡主升走肝，枢转气机，疏散郁结，使阳气透达于表，枳实主降走脾，破气行痰，散结消痞，使浊气通利于下，共使枢机运转，肝脾调和，诸症自愈。小青龙汤中细辛与五味子相伍，用细辛之辛散，五味子之酸收，相须为用，相得益彰，止咳平喘功效增强。(4)气分药和血分药相配伍，治疗气血亏损、气血逆乱：“气为血之帅，血为气之母”，两者相互依存，相互为用。在病理情况下，气虚则引起血虚，气滞则引起血瘀，反之亦然。因此，气血病变，补气药和养血药，行气药与活血药，往往相须为用。《黄帝内经》曰：“形不足者温之以气，精不足者补之以味。”气行则血行，气滞则血滞，故张仲景在治疗气血病变时，补气药和补血药并用，行气药和活血药并用，清气分药和凉血分药并用。如人参、当归相伍，人参补气，当归补血；枳实、芍药相伍，枳实行气，芍药活血；百合、地黄相伍，百合清气分之热，地黄凉血分之热等，均属于这类配伍方法。3、君药与臣、佐、使药相伍，提高君药治疗效果。方剂的组成原则概括起来是君、臣、佐、使。对药的配伍亦包涵了这样的内容。即选用针对病因或疾病本质或主证而起主要治疗作用的药物作君药，以解决疾病的主要矛盾；同时辅以协助之药，增强药效，作为臣药；配以治疗兼证，或监制主药，制约其毒性和烈性的药物，作为佐药；配以具有引经和调和作用的药物，作为使药。如麻黄与桂枝相伍，麻黄发汗解表为君，臣以桂枝，则使麻黄发汗解表之力倍增。半夏与生姜相伍，两者相须为用，降逆止呕功妙。同时半夏与生姜又具有相畏关系，使半夏毒解。大黄和甘草相伍，甘草既能缓和大黄峻攻下行之性，又能使其清胃热而不伤正。4.、改变药物的用量，治疗不同性质疾病。在对药组成不变的情况下，通过调整其用量，改变对药的原有功效。如桂枝和芍药相伍，两者用量相等，桂枝助卫气，散风邪；芍药益营气，养阴液，从而使营卫调和，表解邪去。若两者相伍，加大芍药用量，两者之比例变为1：2，此时芍药成为君药，桂枝成为臣药，两者相伍，酸甘化合，收多于散，药物功能则变成了补脾和中，缓急止痛。若两者相伍，加大桂枝用量，这时桂枝与芍药相伍的功效不再是调和营卫，而变成了温阳降逆平冲的功效。又如小承气汤、厚朴三物汤、厚朴大黄汤三方都是由大黄、枳实、厚朴所组成，但小承气汤用大黄四两为君药，臣以枳实三枚，厚朴二两，目的在于泻热通便，用于肠胃热结，大便秘结证；厚朴三物汤用厚朴八两，大黄四两，枳实四枚，以厚朴、枳实为君，臣以大黄，目的在于除胀消满，用于肠胃气滞，腹部胀满证；厚朴大黄汤用厚朴一尺，大黄六两，枳实四枚，以厚朴、大黄为君，臣以枳实，目的在于开胸泄饮，用于治疗水饮停于胸胁，咳饮作痛的支饮证。此外，有些对药的临床功效由于煎法和炮制方法不同，其功能亦发生相应变化。如大黄与黄连相伍，有水煎和浸泡之分，水煎取其气和味泻胃火以止吐血；浸泡取其气清胃热以消痞满。生附子与干姜相伍，重在回阳救逆；炮附子与干姜相伍，则重在温经祛寒止痛。总之，在临床实践中，既要掌握张仲景对药组成的基本原则，又要熟悉每味药的性味功能，根据不同情况，灵活运用，使药物在配伍之后能更好地发挥其功效，提高临床治疗效果，扩大药物的使用范围。

近日，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所成功构建一种多功能纳米平台 CeO₂/3TT@NP-RVG，该平台能够穿越血脑屏障并实现神经元靶向递送，在脑炎的精准成像与治疗方面展现出巨大的应用潜力。相关研究成果于近日发表在《生物材料（Biomaterials）》上。脑炎是一种危及生命的神经系统疾病，具有高死亡率和严重的长期神经后遗症。目前，由于缺乏针对潜在病理机制的有效治疗手段，加之血脑屏障（BBB）的阻碍，现有临床干预多局限于症状缓解，难以有效抑制铁死亡及活性氧（ROS）介导的神经毒性。该研究提出了融合分子机制干预与精准成像的诊疗一体化新策略，创新性地构建了CeO₂/3TT@NP-RVG纳米平台。该平台能够实现深组织分辨率下的脑炎实时成像，协同清除ROS、抑制炎症因子（TNF-α、IFN-β），并通过泛素化介导下调POR-ACSL4-LPCAT3通路以抑制铁死亡，从而显著提高脑炎小鼠模型的生存率。牛羊传染病创新团队博士后王骞若为论文的第一作者。哈尔滨兽医研究所尹鑫研究员、吉林大学李媛媛教授、香港中文大学(深圳）唐本忠院士为论文的共同通讯作者。该研究得到国家重点研发计划(2022YFE0140700)、吉林省科技发展计划(20240101266JC)及广东省重点领域研发计划(2024B0101040001)等项目资助。原文标题及链接：“Inflammation-Targeted Nanoplatform: NIR-II Imaging-Guided Encephalitis Suppressing by Dual Antioxidant-Ferroptosis Action”https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S014296122500660X?dgcid=coauthor

摘要小干扰 RNA 通常通过序列特异性降解 mRNA 来阻断基因表达。我们此前开发了一种重组腺病毒，该病毒由 U6 启动子驱动，表达三种靶向口蹄疫病毒（FMDV）的短发夹 RNA（Ad-3siRNA）。这些短发夹 RNA 对 FMDV 表现出快速的抗病毒作用。在此，我们研究了 Ad-3siRNA 与口蹄疫灭活疫苗联合使用的免疫刺激效果。通过将 Ad-3siRNA 与口蹄疫（FMD）灭活疫苗联合使用，我们观察到在接种后 1 周内保护效力增强，且小鼠从接种后 1 周开始中和抗体水平升高。此外，接种疫苗和 Ad-3siRNA 联合制剂的猪，接种后 7 周内体液免疫显著增强。Ad-3siRNA可诱导小鼠产生多种细胞因子，如IFN-α、IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-15和IL-18。总之，我们证明了 Ad-3siRNA 是一种通过人腺病毒载体递送的新型免疫刺激 RNA，与 FMD 灭活疫苗联合使用时可增强保护作用和体液免疫。Ad-3siRNA在其他病毒性疾病中的应用及进一步的机制研究尚需进一步探索。1. 前言RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术是通过小分子干扰RNA（small interfering RNAs，siRNA）或短发夹RNA（short hairpin RNAs，shRNA）引导的序列特异性 mRNA 降解来抑制基因表达。已有报道称RNAi应用存在非特异性 “脱靶效应”。免疫刺激性 siRNA（isiRNA）除了抑制靶标表达外，还能触发先天免疫反应。免疫激活通过视黄酸诱导基因 I（RIG-I）、黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA-5）、蛋白激酶 R（PKR）、toll样受体（TLR）3或TLR7/8发生。最近，有报道称isiRNA具有抗病毒和抗肿瘤潜力。此外，isiRNA作为疫苗佐剂已被研究，可增强体液和细胞免疫。口蹄疫（FMD）是一种急性传染性疾病，可感染牛、猪、羊和山羊等偶蹄动物。导致其发热，口腔、舌头、乳头和蹄部起水泡。口蹄疫病毒（FMDV）是一种单链正链 RNA 病毒，属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，有7个血清型和 60 多个亚型。目前使用灭活疫苗预防 FMDV 传播，但是，应用过程中应根据血清型和亚型选择不同的疫苗株。此外，使用现有的FMD疫苗形成抗体以控制FMD的爆发是一个漫长的过程。因此，在疫苗诱导的保护性免疫形成之前，可使用抗病毒药物在爆发期间提供快速保护并减少 FMDV 的传播。最近，我们建议将具有佐剂作用的抗病毒药物与 FMD 灭活疫苗联合使用，以实现早期保护和增强疫苗免疫。建议的抗病毒药物是长效猪干扰素（IFN）-α和I型IFN诱导剂，如槲皮素。我们观察到I型IFN和IFN诱导剂在体内能有效增强免疫力并抑制 FMDV 复制。最近，我们建议将具有佐剂作用的抗病毒药物与 FMD 灭活疫苗联合使用，以实现早期保护和增强疫苗免疫。建议的抗病毒药物为持续时间改善的猪干扰素（IFN）-α 和 I 型 IFN 诱导剂，如槲皮素。我们观察到I型IFN和IFN诱导剂在体内能有效增强免疫力并抑制FMDV复制。我们开发了一种重组腺病毒，可同时表达三种靶向 FMDV非结构蛋白区域的三种短发夹RNA（shRNA），其中Ad-3siRNA能诱导快速（在感染后6小时内）且有效的FMDV抑制。通过利用5型人腺病毒递送载体，它可直接应用于包括小鼠和猪在内的多种宿主。我们建议通过联合使用 siRNA和I型IFN以产生快速起效且持久的保护力从而控制猪群中FMD。然而，我们并不排除Ad-3siRNA作为IFN诱导剂的潜力，因为除了一些isiRNA报道之外，还有关于Ad-3siRNA可刺激猪细胞中的干扰素刺激基因（ISG）的报告。在此，我们研究了Ad-3siRNA与FMD灭活疫苗联合使用的免疫刺激效果，重点关注猪细胞中I型IFN的产生和 ISG 的表达，以及Ad-3siRNA与FMD疫苗联合使用在小鼠和猪中诱导的中和抗体滴度。2. 材料和方法2.1 细胞和病毒人胚胎肾（HEK）293细胞：在含4mM L-谷氨酰胺的293无血清培养基中培养，置于37°C、5%CO₂培养箱中。猪肾（IBRS-2和LFBK）细胞使用添加10%胎牛血清（FBS，pH7.4）的DMEM培养基在37℃、5%CO2培养箱中进行培养。表达5型人腺病毒E1 DNA的HEK293细胞用于扩增重组腺病毒和进行腺病毒滴度测定。IBRS-2 细胞用于测试干扰素和 ISG 诱导。LFBK细胞用于病毒中和试验和FMDV滴度测定。表达多种靶向 FMDV 的 siRNA的重组腺病毒（Ad-3siRNA）和重组腺病毒阴性对照（Ad-null control）由我们实验室建立。三种shRNA靶向FMDV基因组的高度保守的2B和3C区域（图 1A）。腺病毒DNA包含三个U6启动子、shRNA 编码序列（2B、3C2和 3C1 shRNA）以及含六个胸苷的pol III 转录终止子（图 1B）。韩国FMDV分离株O/SKR/Boeun/2017（GenBank登录号MG983730）用于评估抗病毒效果，FMDV A/SKR/Yeoncheon/2017（GenBank登录号KR766148）用于病毒中和抗体检测。使用Karber法测定和计算病毒滴度（Ramakrishnan，2016）。图1. Ad-3siRNA示意图。（A）口蹄疫病毒全基因组示意图。黑色箭头表示shRNA的靶区域。（B）Ad-3siRNA的构建。腺病毒DNA含有三个U6启动子、shRNA编码序列（2B、3C 2和3C 1 shRNA）和pol III转录终止子。2.2 I型干扰素蛋白检测将 IBRS-2细胞（3×10⁵个细胞/孔）接种到 24 孔板中。次日，用50感染复数（MOI）的Ad-3siRNA或Ad-null control感染细胞，在37°C下孵育。感染后2小时用新鲜培养基更换培养基后，将细胞在37°C下孵育。在8、24和48小时收集上清液，使用猪 IFN-α 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒和猪 IFN-β ELISA 试剂盒测量上清液中的猪 IFN-α 和 IFN-β 水平。2.3 干扰素测定如前所述，通过基于 FMDV 的 IFN 测定分析 24 和 48 小时收集上清液的抗病毒活性。简而言之，将 LFBK 细胞在 96 孔板中培养至90%。然后加入两倍稀释的上清液。24小时后，移除上清液，每孔用250 TCID50的FMDV 感染 1小时，并在 37°C下孵育 48 小时。在诱导 50%细胞病变效应（CPE）抑制的最高稀释度下测量抗FMDV的抗病毒活性（单位）。2.4 动物实验7 周龄雌性C57BL/6小鼠，BALB/c小鼠，FMDV中和抗体阴性（中和抗体滴度2.4.1 小鼠保护作用分析C57BL/6小鼠（每组5只）在攻毒前1天或7天通过肌内注射 FMD 疫苗、Ad-3siRNA 或 Ad-null control 的组合（3×10⁸ TCID50/dose）或PBS，以评估对FMDV的保护作用。FMD 灭活疫苗由A/SKR/Yeoncheon/2017的FMD疫苗抗原（0.25 μg /dose）、10%氢氧化铝凝胶和Montanide ISA 206配制而成。通过腹腔注射250LD50的小鼠适应型 FMDV A/Malaysia/97攻击小鼠。在攻击后8天内监测小鼠的存活率。2.4.2 小鼠体液免疫测定（短期）为分析接种后三周的中和抗体水平，使用C57BL/6小鼠（每组5只），通过肌内注射FMD疫苗、Ad-3siRNA或Ad-null control（3×10⁸ TCID50/dose）的组合或PBS。FMD 灭活疫苗使用A/SKR/Yeoncheon/2017 的疫苗抗原（1μg/头份）、10% 氢氧化铝凝胶和 Montanide ISA 206配制而成。在接种后1、2和3周采血分离血清。2.4.3 猪体液免疫测定（长期）为长期分析抗体水平，对猪（每组4只）通过肌内注射FMD疫苗、疫苗和Ad-3siRNA 的组合或Ad-null control（1×10¹⁰TCID50/头份），不进行加强免疫。在 1、3、5和7周采血分离血清。2.4.4 病毒中和试验（VNT）小鼠和猪血清在56℃下热灭活30 min备用，按照《陆生动物诊断测试和疫苗手册》（WOAH，2022）指南进行病毒中和试验。在LFBK细胞中传代四次的 FMDV A/SKR/Yeoncheon/2017用于VNT。2.4.5 小鼠中细胞因子测定如前所述进行小鼠细胞因子测定。每组4只BALB/c小鼠通过腹腔注射 0.1mL的Ad-3siRNA或Ad-null control（3×10⁸ TCID50/dose）。在接种后0、16、24和48小时采血分离血清，血清用于使用小鼠 IFN-α、IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-15和 IL-18 ELISA试剂盒测量 IFN-α、IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-15 和 IL-18 的浓度。通过标准曲线插值确定蛋白质浓度。2.5 猪细胞的逆转录-定量PCR（RT-qPCR）分析将 IBRS-2 细胞（1×106个细胞/孔）接种到6孔板中，用50MOI的Ad-3siRNA 或 Ad-null control感染，并在 37°C 下孵育。在24和48小时收集细胞。如前所述进行 RNA 提取、DNase I处理和RT-qPCR。RT-qPCR检测2'-5' OAS、PKR 和 Mx mRNA的ISG 表达分析以及RLR信号相关基因RIG-I、MDA-5和核因子 κB 激酶ε抑制剂（IKKε）的表达。猪甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）用作内参。2.6 统计分析使用GraphPad Prism进行非配对t检验。3. 结果3.1 Ad-3siRNA对猪细胞I型干扰素的诱导作用测量用 Ad-3siRNA 或 Ad-null control 处理的猪细胞上清液中的IFN蛋白水平和抗病毒活性。与Ad-null control感染的细胞上清液相比，在Ad-3siRNA感染的细胞上清液中，24小时感染后检测到更高水平的猪IFN-α蛋白（图2A，P图2.检测用Ad-3siRNA感染的猪细胞的上清液中的I型IFN（A）猪IFN-α蛋白水平、（B）IFN-β蛋白的水平、(C)使用Ad 3siRNA感染的猪细胞的上清液测量抗FMDV活性3.2.Ad-3siRNA 与 FMD 疫苗联合在小鼠中引发早期保护和增强的中和抗体水平为测试Ad-3siRNA与FMD疫苗在接种后1周内的保护效果，监测接种疫苗和Ad-3siRNA的小鼠的存活率（图3A和B）。与PBS组小鼠相比，注射疫苗、疫苗+Ad-null control或疫苗+Ad-3siRNA的小鼠存活率更高。然而，接种后1或7天，疫苗+Ad-3siRNA组的存活率（100%）均显著高于疫苗组或疫苗+Ad-null control 组。为评估Ad-3siRNA在接种早期对体液免疫的影响，测量了免疫后3周的中和抗体滴度（VN 滴度）（图 3C）。疫苗+ Ad-3siRNA组在接种后1、2和3周的VN滴度均高于疫苗组或疫苗+ Ad-null control组（P图3. 小鼠生存曲线和中和抗体水平（A）在FMDV感染前1天小鼠生存曲线，（B）在FMDV感染前7天小鼠生存曲线(C)血清中和抗体试验结果。虚线表示1：32（log 10 1.5）病毒中和滴度临界水平。3.3 Ad-3siRNA与口蹄疫疫苗联合应用增强猪体液免疫情况为评估Ad-3siRNA 对自然宿主体液免疫的持续影响，给猪单次注射疫苗或疫苗与Ad-3siRNA（或 Ad-null control）的组合，监测免疫后7周中和抗体滴度（图 4）。疫苗+Ad-3siRNA 组在免疫后第3、5和7周的VN滴度高于疫苗组或疫苗+ Ad-null control组（P图4.猪中病毒中和抗体水平3.4 ISG和RLR的上调测量用Ad-3siRNA或Ad-null control 处理的猪细胞中ISG（如寡腺苷酸合成酶（OAS）、粘液病毒抗性（Mx）和 PKR）的mRNA水平。与Ad-null control感染或未处理的细胞相比，Ad-3siRNA感染的细胞中观察到显著升高（P图5. Ad-3 siRNA上调猪细胞干扰素刺激基因和RIG-I样受体信号相关基因表达3.5 Ad-3siRNA 在小鼠中诱导细胞因子为分析Ad-3siRNA在体内诱导的细胞因子，测量腹腔注射Ad-3siRNA的小鼠血清样本中的细胞因子水平。与接种Ad-null control的小鼠相比，注射Ad 3siRNA的小鼠在16-48小时内的IFN-α、IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-15和IL-18水平显著升高（图6，P 图6. Ad-3siRNA 在小鼠中诱导细胞因子4. 讨论SiRNA可用于安全快速的抗病毒治疗策略中。然而，外源性siRNA的作用持续时间短，并且靶病毒可进化出抗性机制以避开 siRNA。在某些情况下，siRNA诱导先天免疫，从而影响其疗效。然而，免疫激活可能有利于控制病毒感染，isiRNA可能促进长期和广谱的抗病毒作用。在本研究中，我们提出表达多种抗 FMDV siRNA的重组腺病毒（Ad-3siRNA）作为一种新型免疫调节剂，它可诱导包括I型IFN在内的多种细胞因子，并与 FMD 疫苗联合使用时具有佐剂作用。Ad-3siRNA旨在抑制多种血清型的 FMDV。Ad-3siRNA 是一种直接作用的 FMDV抑制剂，这也是其作用迅速的原因。靶区域是2B和3C基因，已知它们是FMDV基因组中最保守的区域。我们先前观察到仅注射Ad-3siRNA的乳鼠对FMDV有保护作用（7天存活率约90%）。这种抑制可能是由于多种siRNA的基因沉默，而非免疫调节导致，因为乳鼠没有包括先天免疫在内的成熟的免疫系统。此外，由于半衰期短，进行了三次Ad-3siRNA注射。有鉴于此，我们采用Ad-3siRNA与I型IFN（猪IFN-α）联合使用，以克服siRNA的缺点，如作用时间短和因病毒突变而降低效力。I型IFN（或IFN诱导剂）通过增强抗病毒作用和体液免疫，可能是一种有前景的快速有效保护策略。在本研究中，我们清楚地表明Ad-3siRNA在体外和体内诱导I型IFN，因此可有效用作FMD疫苗佐剂。Ad-3siRNA与FMD疫苗联合使用时，除了增强体内中和抗体的产生外，还刺激了多种细胞因子的产生，如I型IFN、IFN-γ、IL-12、IL-15、IL-6和IL-18。据报道，IFN-α为FMD疫苗的有效佐剂。此外，IFN-γ、IL-12 和 IL-15 参与 T 细胞免疫并对病毒复制产生抑制作用。IL-18刺激B细胞增殖、IFN-γ产生和辅助性T细胞2（Th2）反应。IL-6也是B细胞活化的关键细胞因子。尽管Ad-3siRNA诱导细胞因子，但我们在实验小鼠和猪中未观察到副作用。在我们的小鼠实验中未观察到体重减轻、异常运动或死亡。在猪实验中，我们同时使用Ad-3siRNA和FMD疫苗，也未观察到死亡、异常运动或皮疹。注射I型IFN或IFN诱导剂的动物通常会出现暂时性体温升高。然而，这种症状通常在1到2天内消失，并且在Ad-3siRNA组中不明显。Ad-3siRNA 的佐剂有效性和安全性是剂量依赖性的，应在猪中进行实际应用测试。除佐剂作用外，Ad-3siRNA诱导I型IFN在控制病毒方面可能具有优势。（1）我们认为Ad-3siRNA 的抗病毒作用可能通过其免疫调节作用介导。I型IFN是对抗FMDV产生的最有效的抗病毒蛋白之一。此外，我们观察到小鼠对FMDV的保护作用（100% 存活率）在注射后7天得以维持。I型IFN广泛抑制病毒复制并刺激免疫细胞，包括树突状细胞、B细胞和T细胞。（2）尽管Ad-3siRNA最初被开发为一种仅靶向FMDV的siRNA，但我们观察到它具有广泛的抗病毒效果，不仅限于FMDV，还针对BEV和PRRSV。众所周知，I型IFN对多种病毒具有抗病毒作用。在不同种属（如猪、牛和猴）的细胞中观察到这些效应。除了诱导小鼠IFN-α和IFN-β外，还在猪细胞中也诱导猪IFN-α和IFN-β。此外，本研究中使用的人腺病毒载体具有广泛的宿主范围，包括猪和牛。已有几项使用5型人腺病毒载体控制FMDV的研究报道。因此，我们认为Ad-3siRNA可用于不同动物体内抗多种病毒的研究。人腺病毒5型在 HEK293细胞中产生。可产生高滴度的重组腺病毒（10¹¹⁻¹² pfu/mL），并且在 HEK293细胞中可进行悬浮培养。我们认为，由于Ad-3siRNA 在293细胞中不产生蛋白质，因此在家畜中的应用不需要特殊的纯化过程。我们使用CRISPR Cas-9技术开发了IFNAR KO 293悬浮细胞系，并且在这些细胞系中获得更高滴度的重组腺病毒。因此，我们认为，对于5型腺病毒载体的应用，成本不会是一个重大问题。实际生产成本取决于公司的生产效率。此外，应考虑家畜的效果和成本来确定最佳剂量。Ad-3siRNA的免疫刺激作用机制尚不清楚。一种可能性是Ad-3siRNA可通过 RIG-I和（或）MDA-5信号传导诱导先天免疫。RLRs是检测病原体相关分子模式并启动包括I型IFN表达在内的抗病毒反应的细胞质 dsRNA传感器。RLRs包括MDA-5、RIG-I和遗传学与生理学实验室 2（LGP2）。其中，MDA-5和RIG-I与病毒RNA的结合触发信号级联以诱导I型IFN表达。我们观察到，尽管在RIG-I敲除细胞和对照细胞中OAS的mRNA水平上调，但在MDA-5敲除细胞中未增强（图S1）。还表明Ad-3siRNA可能是RIG-I和MDA-5的双重激动剂，可上调RIG-I、MDA-5和IKKε的表达。在基因设计方面，我们认为使用多个shRNA和U6（Pol III）启动子表达shRNA可能是Ad-3siRNA诱导I型IFN的关键因素。先前的研究也报道，与 Pol II 启动子相比，具有 U6（RNA 聚合酶III）启动子表达 shRNA 的病毒载体更可能诱导 IFN。此外，观察到与三种shRNA不同，用表达由U6启动子驱动的单个shRNA的腺病毒处理的细胞中，ISG mRNA没有上调。因此，有必要详细研究Ad-3siRNA引发的IFN信号传导机制。总之，我们的研究表明，通过人腺病毒载体递送的新型免疫刺激RNA Ad-3siRNA是一种有前景的佐剂，它可诱导多种细胞因子并通过刺激中和抗体产生来增强FMD疫苗的效果。因此，Ad-3siRNA与疫苗联合使用可能更有效地预防FMD的传播。未来，应探索Ad-3siRNA在不同动物的多种病毒性疾病中的应用，并进行详细的机制研究。

近日，中国农业科学院上海兽医研究所家禽病毒病监测预警和防控团队揭示影响新城疫病毒复制和毒力的机制，相关研究成果发表在《Veterinary Research》上。研究背景基质蛋白是新城疫病毒的重要结构蛋白，具有在细胞核和细胞质中穿梭的特性。然而，对于基质蛋白核质穿梭的机制，尤其是其出核“行为”对病毒的作用仍不清楚研究进展该研究通过对比不同基因型新城疫病毒的基质蛋白核输出序列，发现该序列随病毒进化存在显著差异，影响基质蛋白出核和出芽效率，进而影响病毒复制和毒力。进一步研究首次证实该序列通过经典核输出途径介导基质蛋白出核，更新了对新城疫病毒基质蛋白出核机制的认识，为副黏病毒防控提供了新理论依据。NDV M蛋白的NES257-266基序促进M蛋白出核和病毒出芽项目资助中国农业科学院上海兽医研究所博士研究生张耀东为论文第一作者，仇旭升研究员为论文通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金、十四五国家重点研发计划等项目的支持。来源：中国农科院上海兽医研究所

近日，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所猪遗传育种创新团队搭建了Nu核支持向量机NTLS（NuSVR+TPE+LightGBM+SHAP）预测框架，该学习框架在保证计算速度的同时，显著提高了育种值估计准确性。相关研究成果发表在《智能农业技术（Smart Agricultural Technology）》杂志。　　应用机器学习等人工智能方法进行育种值预测是面向未来的育种趋势之一。面对海量大数据选种时，需要同时兼顾计算速度、准确性及可解释性等问题。　　研究团队开发的NTLS机器学习预测框架结合了自动参数寻优、降维、特征提取以及决策树解释等策略，在应用实践中可以显著提高猪育种值预测准确性。研究表明，在达100kg体重日龄、背膘及产活仔数等主选性状方面，该框架的预测准确性比GBLUP等基因组选择方法分别提高5.1%、3.4%和1.3%。同时，此框架还可以大大降低普通机器学习计算时间，并对育种值“黑盒子”进行部分解释。刘欣

会议笔记 | 周宏超：规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征防控与净化实践原创 陆茂林整理 冠牧精准诊断冠牧精准诊断兽医检测专家。检测安心，服务用心。239篇原创内容公众号2025年8月25日至27日，第三届南方动物营养发展论坛暨2025全国猪业好种苗产业链接大会在美丽的海滨城市厦门隆重举办 。本届大会以“新势力·新动能·新高地”为主题 ，汇聚了国内畜牧种养及饲料营养领域的顶尖专家、行业领袖与一线精英 。在为期两天的知识盛宴中，与会专家们围绕饲料营养创新、高健康种猪的营养体系建设、猪群疫病净化与防控及优质种苗产业链发展等关键议题，分享了最前沿的行业洞见与实践方案，共同为产业的升级与破局探索新方向。为将这份宝贵的行业智慧传递给更多同仁，冠牧精准诊断团队特将大会的精华内容梳理提炼。我们将通过“冠牧精准诊断”公众号，与您分享本次大会的学习笔记，希望能与您共同学习，携手进步。敬请持续关注！近年来，猪繁殖与呼吸综合征（PRRS，俗称“蓝耳病”）的流行病学特征日趋复杂，毒株多样性及重组现象频发，给规模化猪场的生产和健康管理带来了巨大挑战。西北农林科技大学的周宏超老师，在这场深度技术分享中，系统性地阐述了规模化猪场在PRRS防控与净化方面的实践经验。本次分享不仅涵盖了最新的流行现状分析，更通过一个详实的净化案例，展示了从“阳性不稳定”到“双阴性”的完整操作路径。周宏超 博士，养猪一线实战专家，国家执业兽医师，西北农林科技大学副教授，硕士研究生导师，中国畜牧兽医学会兽医病理学分会理事。30年来一直在养猪一线从事规模化猪场主要疫病防控与净化，实验室检测，病理学诊断等工作，现为大北农集团正能平台（正能集团）首席专家本次讲座的分享内容主要围绕四大核心模块展开：首先是PRRS的当前流行现状分析，其次是规模化猪场的系统性防控实践，再次是实现PRRS净化的核心策略，最后通过一个完整的净化案例进行实战解读。周宏超老师开篇指出，在养猪业中，生产成本的控制是关键。其中，品种的遗传基因决定了成本的上限，而猪群的健康管理水平，则直接决定了生产成本的下限。一个健康的猪群是实现理想生产效益的基础。一、 PRRS：持续演变的威胁与流行现状周宏超老师首先分析了育肥猪场常见的疾病发病规律。在一张清晰的时间轴图上，他标示出猪只从断奶到出栏（4周龄至26周龄）各个阶段的主要健康威胁。其中，蓝耳病（PRRS）与圆环病毒的危害期贯穿了从4周龄到10周龄的关键保育阶段，并在13-15周龄期间出现抗体转阳。这表明PRRS是影响猪群早期健康和生产性能的核心病原之一，并常与链球菌、支原体等继发感染交织在一起，构成复杂的猪群健康挑战。根据猪场内PRRS病毒的感染和免疫状态，可以将猪场分为六个等级：阳性不稳定场（高流行率）、阳性不稳定场（低流行率）、阳性稳定场（使用疫苗）、阳性稳定场（不使用疫苗）、趋于阴性场，以及最终的目标——蓝耳病净化场。清晰地评估猪场当前所处的等级，是制定一切防控和净化策略的起点。目前，PRRS的流行现状呈现出高度复杂性：· 毒株多样化：美洲型毒株仍以类NADC30毒株流行为主，且其致病性差异显著，其次就是类NADC34毒株，其致病性同样存在差异，主要对怀孕后期的母猪造成流产、死胎等繁殖障碍。· 重组成为主流：以类QYYZ毒株为代表的变异和重组毒株已成为新的流行主力。· 欧洲型毒株检出率增加：欧洲型毒株在国内的检出也愈发普遍，使得整体流行态势更加复杂。PRRS病毒在猪体内排毒和带毒时间非常持久，这是其难以清除的关键原因。周宏超老师列举的数据显示：唾液带毒可长达42天；公猪精液中，野毒可带毒92天；保育育肥猪感染后，病毒血症最长可持续70天；而在扁桃体中，病毒核酸甚至可以持续检出长达225天。尤为关键的是，母猪在妊娠后期感染，其所产仔猪的病毒血症可持续210天，这构成了病毒代代相传的顽固循环。周宏超老师表示在临床观察到的带毒时间比文献报道的更长，这进一步凸显了PRRS防控的艰巨性。总结来说，当前PRRS的流行态势是由疫苗毒株的演化与野毒株的不断重组共同驱动的。特别是类NADC30/NADC34毒株与疫苗病毒的重组频繁发生，加上欧洲型毒株的传入，导致了疫苗的交叉保护效果不足，许多原有的防控策略因此部分失效，亟需更系统性的应对方案。二、系统性防控：构建猪场PRRS的“防火墙”面对复杂的PRRS问题，周宏超老师强调必须采取系统性、结构性的综合防控措施。这套体系的核心在于四个环节：首先要明确防控目标，其次是根据猪场实际情况细化防控方案，最关键的是要有强有力的执行力，最终实现疾病的“可防可控”。周宏超老师以艾滋病的防控技术路线作为类比，来说明PRRS防控的复杂性。人的艾滋病主要是个体层面的控制，而猪场的PRRS则是群体性的问题，其传播途径更广，控制难度更大，需要的是一整套“组合拳”。关键点一：生物安全管控周宏超老师指出“生物安全措施是蓝耳病防控的首要措施！”他进一步解释，70%-80%的生物安全问题，实际上可以通过前期的猪场设计和工艺流程来解决，这是一种结构性的预防。猪场作为一个生产系统，所有进入和流出的元素都伴随着风险。图示清晰地展示了从空气、水源、饲料、人员，到精液、后备母猪等所有输入端，以及废水、粪便、商品猪等所有输出端，都是潜在的生物安全风险点。因此，猪场的选址与工艺流程设计至关重要。理想的选址应远离其他猪场（>3-5km）、屠宰场（>5-10km）和主要公路干线，并优选地形高燥、水源充足且易于隔离的“孤岛”地形，如三面环山、断头路尽头等。一个设计完善的猪场，其外部功能点的布局也十分考究，例如会设置专门针对猪车和料车的两级消毒点、独立的售猪点、烘干房等，并将母猪场设置在核心保护区。在猪场内部布局上，周宏超老师提倡“敬畏行业，适度规模”，并推荐了“网格式小单元管理”模式。其核心设计理念包括：功能区（隔离区、生活区、生产区、无害化处理区）清晰划分；严格遵循“全进全出”的大批次生产节奏；脏、净区（红、灰、绿区）严格分离；确保人员、物资、猪只单向流动，交叉最小化。关键点二：猪群流动管控周宏超老师推荐采用“两点式”生产流程，即将繁育场和保育育肥场分开。在繁育场内部，实现种猪自给自足（自供后备母猪），并严格执行批次化管理（如36天一批），实现真正的“全进全出”。在完善的生物安全体系基础上，可以科学地为疫苗免疫“减负”。周宏超老师以一个4992头母猪场的设计思路为例，猪群的流动被严格规划，从隔离区到生产区，再到售猪出口和场外无害化处理区，都形成了闭环且单向的路径。为了支撑精准的健康管理，猪场前置的移动检测实验室也必不可少，其内部布局严格遵循单向流原则，从分样核酸提取间、配液间到扩增间，人流、物流、气流均单向流动，防止交叉污染。与母猪场配套的保育育肥场设计也遵循同样的逻辑，确保上下游环节的生物安全能够无缝衔接。这些设计最终服务于明确的生产目标。关键点三：批次化生产批次化生产是现代规模化猪场防控非洲猪瘟和PRRS等重大疾病的有效手段。其优势体现在：减少出猪频率，降低外部病原引入风险；便于产房实现整场（线）的“全进全出”，有效切断PRRS和流行性腹泻的传播链；提升人员工作效率；提高批次内猪群的抗体整齐度。关键点四：精液双阴性 周宏超老师特别强调，外购精液必须确保PRRS病原阴性，因为精液是引入PRRS的重要途径。研究表明，猪的精液可携带PRRS病毒、伪狂犬病毒、圆环病毒等多种病原。因此，对公猪站和精液的生物安全管控是核心场安全的第一道防线。关键点五：核心场蓝耳病双阴性 实现核心种猪群的PRRS病原与抗体双阴性，是为整个生产金字塔提供健康“芯片”的根本保障。关键点六：后备母猪驯化驯化的核心目的是让场内只流行单一毒株，从而实现免疫稳定。针对阳性稳定场和不稳定场，有不同的驯化方案（疫苗免疫或阳性血清驯化）。周宏超老师提醒，使用阳性血清驯化是“没有办法的办法”，必须确保血清来源“干净”，不含其他病原。通过让后备猪接触场内特定的野毒株，可以获得对同源病毒的终身免疫力，这是一种高效的“消毒”效果。关键点七：合理使用疫苗 疫苗仍是控制PRRS的重要工具。策略上应选择经典的毒株活疫苗与高同源性的灭活疫苗进行科学组合免疫。针对不同状态的经产母猪群（阳性不稳定、阳性稳定、趋于阴性），应采用不同频率和类型的疫苗免疫方案。活疫苗的主要作用是减少临床症状和病毒血症，改善生产指标。但同时必须认识到，PRRS减毒活疫苗存在安全性、毒力返强、长时间排毒、垂直传播以及与野毒重组等固有缺陷。周宏超老师分享了活疫苗与灭活疫苗联合使用的增效机理：在活疫苗或野毒感染“打底”后，再接种灭活疫苗，可以诱导产生更多的中和抗体，提升免疫效果。对于阳性不稳定场的仔猪，应根据本场病原阳性率的高低，在7日龄或14日龄采取不同的免疫策略（灭活苗或“活苗+灭活苗”组合）。关键点八：生产管理水平生产管理的水平决定蓝耳病发病的概率，减少应激、强化消毒、控制继发感染是日常管理的核心。在产房管理上，必须严格执行禁止寄养（或仅做数量均衡）、仔猪“全进全出”、免疫接种“一窝一针头”等关键措施，并加强对水帘、风机等设施的消毒。关键点九：定期检测和监测必须建立常态化的监测体系，例如每3个月对猪群进行一次病原和抗体监测。利用去势液、弱仔猪血清等样本，可以有效评估垂直传播和水平传播的情况，为防控策略的调整提供数据支持。三、 PRRS净化策略：从“共存”到“清除”PRRS净化的最终目标是实现“不免疫无疫”，即猪群的PRRSV核酸与抗体检测均为阴性。周宏超老师介绍了三种主流的PRRS净化方案：1. 清群-建群-长期维持（成本高，但最彻底）；2. 从阳性稳定场出发，通过“免疫-封群-停免-检测-淘汰”的路径逐步净化；3. 从阳性不稳定场出发，通过免疫或血清驯化稳定后，再进行封群净化。具体的净化步骤通常分为两个阶段：· 第一阶段（稳定期）：首先进行封群，通过疫苗或场内病毒对全群进行感染，使猪群免疫状态均一化。同时，配合药物保健和严格的产房管理（McRebel操作），直至场内检测不到病原循环（约需13-33周）。· 第二阶段（净化期）：当连续多批次的断奶仔猪样品检测为阴性后，可解除封群，开始自留后备猪。当自留的后备猪在8周龄以上，病原抗体检测仍为阴性时，即可宣布净化成功。四、净化案例分享：一个260天的“双阴”之路周宏超老师分享了一个西北地区4000头母猪场的PRRS净化实战案例。该猪场选址优越，生物安全硬件设施齐全，为净化提供了良好的基础。该场存栏母猪4000头，后备母猪2000头，采用4条独立生产线和36天批次的生产工艺，仔猪24日龄断奶后转出。第一步：现状调查在净化开始前（9月），团队对场内各阶段猪群进行了系统采样，包括基础母猪、公猪、流产母猪、后备猪和3日龄仔猪的去势液等。调查结果显示：虽然成年猪群病原多为阴性，但抗体阳性率极高（73%-90%），S/P值离散度大。关键的突破口在于，3日龄仔猪的去势液检测出了PRRSV阳性，这表明病毒仍在母猪群中存在垂直传播。基于这些数据，该场被准确评估为“蓝耳病阳性不稳定场（高流行率）”，这是制定后续净化方案的科学依据。第二步：免疫稳定从10月1日开始，该场对全群进行了一次PRRS活疫苗普免，随后在21天后和42天后，又连续进行了两次PRRS灭活疫苗的全群普免。通过“先活后死”的免疫程序，旨在快速建立整齐、稳定的免疫背景。同时，从11月1日开始，停止了产房仔猪的疫苗免疫。第三步：封群净化从项目启动起，猪场便停止引进任何外源后备母猪。从12月1日开始，猪场实现了真正意义上的闭群——不引种，不留种（仔猪断奶即走），并全面停止PRRS疫苗免疫，彻底切断病毒的内外循环。在封群净化期间，严格的产房管理是重中之重。措施包括专人分间饲养、严格的消毒程序、规范寄养（只做数量均衡）、严格执行“一窝一针头”。同时，及时淘汰无价值的病弱仔猪、保证断奶仔猪“全进全出”、对空栏进行彻底的清洗消毒烘干和火焰灼烧，这些都是切断病毒在产房内部循环的关键。此外，还包括仔猪中转销售、料车专车专用，以及对弱仔猪和转出到代养场的仔猪进行持续的病原和抗体检测，形成一个完整的监控闭环。在生物安全管控方面，进一步降低了人员和物资的进出频率，并加强了对粪污的处理（增加排空频率并用消毒剂处理），以减少水平传播的压力。第四步：药物保健与阳性猪淘汰在整个净化期间，每月对全群进行一次为期14天的药物保健（替米考星+多西环素等）。净化过程中的“拔牙”操作至关重要。在封群2个月后，对全群进行检测，淘汰所有PRRS病原阳性猪只。在封群4个月后，再次进行全群检测，同时淘汰病原阳性和抗体阳性的猪只，以加速净化进程。第五步：净化进展跟踪为了实时评估净化效果，猪场每月对标记的母猪和所有公猪进行采血检测，并对每批次的去势液和弱仔血清进行病原学检测。对标记猪群的跟踪数据显示，从12月到次年5月，猪群的平均抗体S/P值从1.3一路下降到0.0，抗体阳性率也从73%降至0。与此同时，对仔猪去势液和弱仔血清的连续监测也显示，病原阳性在项目初期偶有检出，但很快转为持续阴性。最终成果：到次年5月31日，该母猪场实现了连续16批次仔猪去势液和弱仔血清的PRRS病原、抗体双阴性，标志着该场成功达到了“PRRS双阴净化场”的标准。后续，通过持续的生物安全管控和常规保健方案，猪场成功维持了这一来之不易的净化状态。案例小结：本项目以一个4000头规模化母猪场为实践对象，通过系统的流行情况评估、疫苗免疫稳定、严格封群净化、过程评估及净化后维持等一系列工作，在260天内成功实现了PRRS双阴性状态，并已持续稳定维持4个月，为行业内PRRS的净化提供了宝贵的实战经验。冠牧学习心得本次周宏超老师的分享，对规模化猪场的管理者和兽医具有极高的实践指导意义。以下为核心学习心得：· 结构性生物安全是根基： 讲座反复强调，猪场的选址、布局和工艺流程设计是PRRS防控的“第一道、也是最重要的一道防线”。与其在后期疲于应对，不如在猪场建设之初就通过结构性设计，从根本上降低疫病传入和传播的风险。· 净化始于精准评估： 没有调查就没有发言权。在启动任何净化项目前，必须通过系统性的采样和检测，准确评估猪场当前的PRRS感染状态（如“阳性不稳定，高流行”）。这是制定科学、有效净化方案的唯一依据。· “免疫稳定”是“封群净化”的必要前奏： 对于阳性不稳定场，不可贸然直接封群。必须先通过“先活后死”等免疫程序，将猪群的免疫状态调整到相对均一和稳定的水平，为后续的病毒清除创造有利条件，否则净化极易因病毒的持续散播而失败。· 监测是净化的“眼睛”： 持续、多维度的检测是贯穿净化全程的“导航系统”。特别是利用去势液、弱仔血清等样本进行病原监测，能高效、灵敏地反映母猪群的垂直传播情况，是判断净化进展和宣告成功的关键指标。· 淘汰的决心决定净化的速度： 净化不仅是技术活，更是管理上的考验。在净化后期，下决心淘汰所有病原阳性甚至抗体阳性的“带毒”或“带苗”猪只，是加速进程、防止功亏一篑的关键一步。这需要管理层在短期成本和长期收益之间做出果断决策。

非洲猪瘟（African swine fever, ASF）被世界动物卫生组织（WOAH）列为法定报告的动物疫病，是危害世界养猪业的“头号杀手”。自2018年以来，ASF疫情给我国养猪产业造成直接经济损失超过10 000亿元，严重影响肉食品供应、国际贸易以及社会经济稳定。目前，由于没有安全、有效的商品化疫苗用于ASF的防控，我国ASF疫情依然严峻复杂，其持续存在是制约我国养猪业健康发展的瓶颈。非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）基因组庞大，目前不仅许多基因未注释，已注释的基因中也有约50%的基因功能未知。由于人们对ASFV的感染与致病机制的认知有限，制约了安全、高效的 ASFV疫苗的研发。制备ASFV蛋白抗体，将为研究ASFV蛋白功能提供生物材料，对于阐明ASFV的感染与致病机制具有重要意义。近期，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所基础免疫创新团队完成的题为“非洲猪瘟病毒pD345L蛋白单克隆抗体的制备及其表位鉴定”的研究在《中国农业科学》2025年第58卷16期正式发表。该研究构建pET-28a-D345L重组原核表达质粒，将其转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，表达并用亲和层析方法纯化重组的pD345L蛋白（rpD345L）。将纯化的rpD345L与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫5周龄SPF级BALB/c小鼠，每隔两周免疫一次，共免疫3次。第二次和第三次免疫均用弗氏不完全佐剂乳化。第三次免疫一周后通过小鼠颌下静脉采血，分离血清，利用ELISA方法检测血清抗体效价，选取抗体效价高的小鼠加强免疫。免疫3 d后取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）进行融合。将重组GST-pD345L作为包被抗原，利用ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，经过3次筛选得到能够稳定分泌pD345L mAbs的杂交瘤细胞株，注入小鼠腹腔制备腹水。使用单抗亚类鉴定试剂盒鉴定mAbs的重、轻链类型。利用外源过表达的pD345L和ASFV HLJ/18株感染的猪肺泡巨噬细胞（PAMs）为抗原，用制备的mAbs作为一抗，分别进行Western blot和间接免疫荧光（IFA）鉴定。随后将截短的pD345L与GST融合表达，用筛选的mAbs鉴定抗原表位，分析鉴定的抗原表位在不同ASFV毒株中的保守性。结果表明，IPTG诱导后，pD345L以包涵体形式表达，分子量为40.5 kDa。将其免疫BALB/c小鼠后经间接ELISA方法筛选得到2株稳定分泌pD345L mAbs的杂交瘤细胞株，命名为10H3和5G1。His-rpD345L的SDS-PAGE及Western blot鉴定亚类鉴定结果显示，2株mAbs重链类型均为IgG1型，轻链类型为κ链，抗体效价为1:1 638 400。pD345L mAbs的亚类鉴定及腹水效价检测Western blot和IFA结果显示，制备的mAbs均能识别天然表达的pD345L。经Western blot确定抗原表位，结果显示10H3和5G1 mAbs的最小线性B细胞表位分别为1METFVRLFKD10和321YEKICCSEES330，这两个抗原表位在ASFV不同毒株中具有保守性。抗pD345L mAbs识别pD345L的Western blot检测pD345L mAbs识别pD345L的IFA检测Western blot鉴定pD345L mAbs识别的抗原表位综上，本研究原核表达并纯化了rpD345L，制备了2株pD345L mAbs，并鉴定了其识别的抗原表位，且这2株mAbs均能有效识别ASFV感染过程中表达的pD345L，为进一步研究ASFV pD345L功能奠定基础。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所黄丽研究员为该文通讯作者，贺筱萍为第一作者。该研究获得国家自然科学基金（32322081，32270156）、中国农业科学院科学中心项目（CAAS-CSLPDCP-202401，CAAS-CSLPDCP-2023002）的资助。全文链接：《非洲猪瘟病毒pD345L蛋白单克隆抗体的制备及其表位鉴定》贺筱萍, 张元峰, 刘学敏, 黄丽, 翁长江. 非洲猪瘟病毒pD345L蛋白单克隆抗体的制备及其表位鉴定[J]. 中国农业科学, 2025, 58(16): 3345-3356.HE XiaoPing, ZHANG YuanFeng, LIU XueMin, HUANG Li, WENG ChangJiang. Preparation of Monoclonal Antibody Against African Swine Fever Virus pD345L Protein and Identification of Its Epitope[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2025, 58(16): 3345-3356.